刘晓然,夏 欢,王 阳

(西北农林科技大学 植物保护学院,陕西杨凌 712100)

辣椒富含多种营养物质[1],是中国蔬菜的核心产业之一,引入中国至今已经有400多年的历史[2]。辣椒炭疽病是辣椒的三大病害之一,主要由辣椒炭疽菌(Colletotrichum capsici)引起,主要危害辣椒的叶片和果实,影响辣椒的产量和品质,一般减产10%～15%,严重时可减产40%以上,威胁辣椒产业的健康发展[3-4]。目前生产上主要釆用农业综合防治[5]、培育抗病品种[6]、化学农药防治[7-8]和生物防治[9-18]等措施来防治辣椒炭疽病。其中,生物防治因其环保、持效期长,对环境、生态和人类健康安全等优点,已经逐步成为研究热点。

目前,国内外已报道多种生防菌株对辣椒炭疽病菌具有防治作用,主要有生防细菌[9-11]、生防放线菌[12-16]和生防真菌[17-18]。放线菌可以产生多种抗生素、植物激素、水解酶等抑菌活性物质,具有开发生物源农药的潜力[19]。将生防放线菌制备成活细胞制剂,不仅可以改善土壤结构,降低农药残留,而且环境兼容性好,持效期长[20]。本研究以辣椒炭疽病菌为靶标菌,从健康辣椒植株根部筛选得到2株广谱高效的拮抗链霉菌,分别命名为LX-4、LX-18。通过对这两株生防菌的作用机制和发酵液活性进行初步探索,为这两株生防菌的应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

生防菌:从陕西、河南等地健康辣椒根部土壤分离获得。

供试病原真菌有13种,分别为L01:辣椒炭疽病原菌(Colletotrichum capsici)、L02:烟草赤星病菌(Alternaria alternate)、L03:番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、L04:苹果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、L05:玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)、L06:小 麦 赤 霉 病 菌(Fusarium graminearum)、L07:油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、L08:白菜黑斑病菌(Alternariabrassicae)、L09:梨 腐 烂 病 菌(Valsaambiens)、L10:小麦茎基腐病菌(Fusarium pseudograminearum)、L11:香 蕉 叶 枯 病 菌(Pseudocer cosporafijiensis)、L12:石榴干腐病菌(Coniella granati)、L13:黄瓜靶斑病菌(Corynespora cassiicola),由西北农林科技大学蔬菜病害及生物防治实验室保存提供。

1.2 试验方法

1.2.1 生防菌的筛选及抑菌活性检测 用土壤稀释法[21]从健康辣椒植株的根际土壤样品中分离、纯化得到放线菌,以辣椒炭疽病菌等13种病原真菌为靶标进行筛选,采用平板对峙法测定土壤放线菌的拮抗作用。于PDA上划线培养生防菌,并在距其4 cm的位置接种靶标菌菌饼(D=6 mm),以仅接种靶标菌的培养基作为对照,28℃恒温培养,记录抑菌带宽度。每个处理重复3次,记算抑菌带宽度。

1.2.2 生防菌多相分类鉴定 形态特征观察:将2株生防菌划线接种于ISP3培养基上,在培养基上45°角倾斜插入无菌盖玻片,培养至菌丝孢子长出后取出盖玻片制成扫描样品,用扫描电子显微镜观察其菌丝和孢子特征并拍照。

培养特征观察:将2株生防菌接种于PDA培养基、GS培养基以及ISP1、ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、ISP6和ISP7培养基,28℃恒温生长15 d,依据《链霉菌鉴定手册》[21]观察并记录两株菌株生长状况是否良好,以及基内菌丝、气生菌丝的颜色和是否产生可溶性色素,作为两株生防链霉菌定种的依据。

生理生化测定:生防链霉菌的多项生理生化指标参考《链霉菌鉴定手册》[22]进行测定。

16S r DNA测序及进化树构建:参照CATB方法提取放线菌DNA进行16S r DNA基因序列的PCR扩 增,引 物:27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′,浓度10μmol/L;反应体系(25 μL):Master Mix 12.5μL,上游引物1μL,下游引物1μL,基因组DNA模板2μL,dd H2O 8.5 μL;反应条件:94℃预变性5 min,94℃变性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸90 s,循环35次,最后72℃延伸10 min。扩增产物由擎科生物科技有限公司进行测序,将测序结果在EzBioCloud网站进行同源序列比对,用MEGA 6.06软件进行序列分析并构建系统进化树[23]。

1.2.3 生防放线菌对辣椒出芽率以及对辣椒幼苗生长的影响 将2株生防菌在PDA培养基上划线培养7 d后,用无菌水冲洗收集孢子,通过血球计数板计数配制浓度为107CFU/m L的孢子悬浮液。用两株菌的孢子悬浮液分别对消毒的辣椒种子进行拌种,然后种植到盛有灭菌基质的育种穴盘内,每组种植60株,以无菌水处理作为对照,7 d后统计辣椒的出苗率,然后将每组处理选取15株长势均匀的辣椒幼苗移栽到小花盆中,20 d后统计其株高和根长。每处理重复3次。

1.2.4 生防放线菌次生代谢产物检测 参照Awla等[24]的研究方法测定菌株的产几丁质酶、产β-1,3-葡聚糖酶、产蛋白酶、产纤维素酶、产脂肪酶、产噬铁素能力、产ACC脱氨酶能力。

1.2.5 放线菌发酵液中抗真菌活性成分的初步探究 PDB培养液中接种两株放线菌菌饼(D=6 mm),28℃、180 r/min恒温振荡培养7 d获得两株菌的发酵液,5 000 r/min离心10 min收集发酵上清液,随后按照极性从小到大分别依次加入二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取,旋转蒸发干燥后收集3种有机相中的物质并称重。取各个萃取相的物质溶于甲醇中配制成浓度为100 μg/m L的溶液,取各相甲醇溶液100μL与10 m L PDA混匀后倒平板,以加等量甲醇的PDA作为对照,28℃培养5 d后用十字交叉法测量对照组和各处理组的菌落直径,试验重复3次,抑制率计算公式如下:

菌丝生长抑制率=(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/对照组菌落直径×100%

1.2.6 发酵滤液稳定性检测 分别从温度、p H、紫外光处理和光照处理4个方面分析放线菌发酵液的稳定性。将待测菌株的发酵滤液分别在20℃、40℃、60℃、80℃、100℃下处理1 h,在紫外灯下分别照射30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min、210 min、240 min,日光灯下分别照射12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h,调节发酵滤液的p H为2、4、6、8、10、12处理1 h后调回原始值。取1.5 m L处理后的发酵滤液与15 m L PDA培养基混匀后倒板,以加1.5 m L无菌水的PDA作为对照,28℃培养5 d后用十字交叉法测量各处理组和对照组的菌落直径,试验重复3次,计算抑制率。

1.3 数据分析

采用IBM SPSS Statistics 21.0对试验数据进行统计学分析,采用Duncan’s多重比较法进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 拮抗放线菌筛选

拮抗放线菌筛选结果表明(表1),LX-4、LX-18两个菌株呈现出广谱的抗真菌活性,对供试的13种不同病原真菌均有抑制作用,其中LX-18对13种病原菌的抑菌半径均大于10 mm。LX-4、LX-18均对辣椒炭疽病菌有很强的抑制作用,LX-4对辣椒炭疽病菌抑菌半径宽达14.33 mm,LX-18对辣椒炭疽病菌抑菌半径宽达21.33 mm(图1)。

图1 生防菌株对辣椒炭疽菌的皿内抑菌效果Fig.1 Antagonistic effect of biocontrol strains against Colletotrichum capsici in dishes

表1 两株放线菌对13种植物病原真菌的抑制作用Table 1 Inhibitory effects of two actinomycetes on 13 plant pathogenic fungi

2.2 放线菌分类鉴定

2.2.1 扫描电镜观察 扫描电镜下观察到菌株LX-4菌丝丰富,无横隔、无断裂,孢子丝链状卷曲,孢子椭圆状,两端略扁,表面较粗糙,孢子长度大约1～2μm;菌株LX-18菌丝丰富,无横隔、无断裂,孢子丝长链状,孢子为表面光滑的短杆状,孢子长度大约0.5～2μm(图2)。

图2 LX-4和LX-18扫描电镜图Fig.2 Scanning electron microscope of LX-4 and LX-18

2.2.2 培养特征观察 观察结果显示(表2),菌株LX-4气生菌丝多呈灰白色,基内菌丝在不同培养基上颜色有差别,主要有黄色、白色、砖红色,在所有测试培养基上均不产生可溶性色素,在ISP2、ISP3、ISP7、PDA培 养 基 上 长 势 好,在ISP1、ISP4、ISP6、GS培养基上长势差;菌株LX-18的气生菌丝在ISP1上呈现淡黄色,在其他培养基上多呈灰色或白色,基内菌丝在不同培养基上颜色有差别,主要有灰白色、灰黄色、黄褐色,在ISP6培养基上产生棕黑色可溶性色素,在ISP2、ISP3、ISP5、ISP7、PDA培 养 基 上 长 势 好,在ISP1、ISP4、ISP6培养基上长势差。

表2 两株放线菌的培养特征观察Table 2 Culture characteristics of two actinomycetes

2.2.3 生理生化鉴定结果 生防放线菌LX-4和LX-18的相关生理生化指标特征测定结果(表3)表明,生防菌LX-4和LX-18均能产生接触酶;LX-4菌株有良好的明胶液化能力,吲哚试验显阳性,无淀粉水解能力;LX-18菌株有良好的淀粉水解能力,无明胶液化能力,吲哚试验显阴性,两株菌均没有产硫化氢和黑色素的能力。

表3 两株放线菌的生理生化特征Table 3 Physiobiochemic character of two actinomycetes

2.2.4 生防放线菌的16S r DNA序列的系统发育分析 16S r DNA序列的同源性分析结果显示,菌株LX-4与Streptomyces angustmyceticus(NRRL B-2347)有最高的序列相似性99.93%,并在78%水平聚在进化树上同一支,LX-4最终鉴 定 为S.angustmyceticus;菌 株LX-18和Streptomyces luteogriseus(NBRC 13402)有最高的序列相似性100%,并在99%水平上聚在进化树上的同一支,LX-18最终鉴定为S.luteogriseus(图3)。

图3 菌株LX-18和LX-4的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of strains LX-18 and LX-4

2.3 生防放线菌对辣椒出芽率的影响及对辣椒幼苗的促生作用

在播种后第7天统计各组的出芽率,结果显示,生防菌LX-4和LX-18处理较对照出芽率无显著性差异。在播种后第20天测量了各处理组辣椒幼苗的株高和根长,结果表明,生防菌LX-4和LX-18处理较对照株高均有所提高,增幅分别为21.61%和6.89%;生防菌LX-4和LX-18处理较对照根长也均有所增长,且差异均达显著水平,增幅分别为6.76%和27.48%(表4)。综上可知,LX-4和LX-18对辣椒的生长均有促进作用,LX-4主要能够增加辣椒的株高,LX-18主要能够增加辣椒的根长。

表4 两株生防菌下辣椒种子出苗率和幼苗生长Table 4 Seed emergence rate and seedling growth of pepper under treatment of two biocontrol strains

2.4 生防放线菌次生代谢产物检测

检测结果表明:菌株LX-4能产生β-1,3-葡聚糖酶、蛋白酶、脂肪酶、铁载体等次生代谢产物;菌株LX-18能产生β-1,3-葡聚糖酶、蛋白酶、脂肪酶、ACC脱氨酶、纤维素酶和铁载体等次生代谢产物(表5)。LX-4和LX-18均能产生β-1,3-葡聚糖酶、蛋白酶、脂肪酶具有降解真菌细胞细胞壁的能力,并能够产生铁载体具有促进辣椒植株生长的能力。

表5 两株放线菌产生次生代谢产物的能力Table 5 Ability of two strains of actinomycetes to produce secondary metabolites

2.5 放线菌发酵液中抗真菌活性成分的初步探究

两株生防菌发酵液的二氯甲烷相、乙酸乙酯相、正丁醇相粗提物对辣椒炭疽菌的抑制作用如图4所示,结果表明,LX-4和LX-18的3种有机相提取物均有抑菌活性,活性产物种类丰富。菌株LX-18发酵液的乙酸乙酯相的抑菌率更高,正丁醇相的抑菌率低,说明发酵液里的主要抑菌物质极性较小;菌株LX-4的正丁醇相的抑菌活性高,二氯甲烷相的抑菌率低,发酵液里的主要抑菌物质极性较大(图4)。

图4 两株菌的抑菌活性成分分布Fig.4 Distribution of inhibition activity components of two strains

2.6 发酵滤液稳定性检测

如图5所示:LX-4和LX-18发酵液的抑菌活性在40℃以内活性稳定,随着温度的升高抑菌活性不断下降;LX-4在酸性环境和碱性环境中抑菌活性都较稳定,LX-18在碱性环境中活性稳定,在酸性环境中抑菌活性降低;LX-4和LX-18发酵液在可见光条件下有较好的稳定性,LX-4在可见光连续照射96 h条件下较对照无显著差异,LX-18在可见光连续照射24 h时活性轻微下降;LX-4和LX-18发酵液在紫外照射60 min后活性显著降低,并随着时间的延长逐渐降低。综上所述,LX-4和LX-18发酵液的的抑菌活性分别在p H 2～12和p H 6～12下稳定,均能在温度低于40℃时和光照96 h内稳定,在紫外照射下活性降低。

图5 不同处理两株菌发酵液抑菌活性Fig.5 Inhibition activities of two strains under different treatments

3 讨论与结论

辣椒炭疽病已成为全球性病害,在成熟的果实上发生严重造成巨大的经济损失。而且引起辣椒炭疽病的病原真菌复杂多样且经常混合发生,病害一旦发生后防治困难,化学杀菌剂在一定程度上可以防治该病害,但化学农药的持续使用对蔬菜安全和农业可持续发展造成了不良影响[25]。目前,国家政策要求对农药减施增效,利用生防菌防治辣椒炭疽病成为一个有价值的课题,国内外已报道了多株对辣椒炭疽病有防治效果的生防菌[9-18]。

本研究通过皿内对峙筛选出LX-4(S.angustmyceticus)和LX-18(S.luteogriseus)两株链霉菌,对供试的13种病原菌均有抑制作用。Prisana等[12]在2019年报道了S.angustmyceticus对炭疽菌和新月弯孢菌引起的结球白菜叶斑病有很好的防治作用,能够释放出挥发性抗真菌化合物,包括醇类、醛类、羧酸类和脂肪酸类,还可以产生多种细胞壁降解酶;藤黄灰链霉菌S.luteogriseus抑菌活性产物种类丰富,人们相继从其发酵液中分离出寡霉素A和C[26]、氨基酸抗生素KT-151[27]等抑菌活性产物,对多种病害都有明显的抑制作用。因此,LX-4和LX-18两株链霉菌均有广谱抑菌活性,具有一定的生防潜力。

土壤微生物与植物之间相互作用,植物将光合作用产生的有机物释放到土壤,供给微生物能源,微生物则将蛋白质、淀粉等大分子物质分解成无机养分释放到土壤中,被植物作为营养源吸收[28],通过增加植物营养来促进植物的生长和发育。此外,植物还可以通过分泌植物激素,产生铁载体等方式促进植物生长。本研究筛选出的两株链霉菌LX-4和LX-18均能促进辣椒的生长,LX-4对辣椒株高的增幅达到21.61%,LX-18对辣椒根长的增幅达到27.48%。次生代谢产物检测结果显示LX-4和LX-18均能产生蛋白酶、脂肪酶和铁载体,初步揭示了两株生防菌的促生机制。

生防菌可以通过生产抗生素、挥发性化合物、合成降解真菌细胞壁的胞外酶、诱导系统抗性以及对营养物和生态位的竞争等方式,保护植物不受各种病原体的影响。真菌的细胞壁主要成分有几丁质、纤维素、葡聚糖、蛋白质和类脂等,生防菌通过产生相关酶类来抑制病原真菌。结果表明LX-4和LX-18均能分泌β-1,3-葡聚糖酶、纤维素酶等次生代谢产物,推测它们能够降解辣椒炭疽病菌的真菌细胞壁而表现出一定的抑制作用。LX-4和LX-18发酵液的二氯甲烷相、乙酸乙酯相和正丁醇相的粗提物均有抑菌活性,说明两株菌能够产生丰富的活性物质。LX-18的乙酸乙酯相粗提物抑菌活性高,该菌主要产生小极性的抑菌活性化合物;LX-4的正丁醇相物质抑菌活性高,该菌主要抑菌活性化合物极性较大。本研究以辣椒炭疽病菌为靶标菌,对LX-4和LX-18的发酵液进行稳定性检测。结果显示,LX-4的发酵液在强酸碱条件下和可见光处理后较稳定,在高温和紫外条件下,抑菌活性明显下降;LX-18的发酵液在碱性条件和可见光处理后较稳定,在酸性、高温和紫外条件下,抑菌活性明显下降。发酵液稳定性测定和初步萃取分离为后续这两株菌的活性物质的分离纯化以及产品的开发提供理论依据。

综上所述,本研究筛选到两株生防链霉菌LX-4和LX-18,次生代谢产物丰富,具有广谱抗真菌活性并能促进辣椒幼苗生长。两株菌的发酵液稳性较强,在病害防治上有良好的应用前景,其实际应用还需进行大田试验验证。