韩 变,李惠霞,刘永刚,石明明,倪春辉,张 敏

(1.甘肃农业大学 植物保护学院/甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室,兰州 730070;2.甘肃省农业科学院 植物保护研究所,兰州 730070)

当归(Angelica sinensis)属伞形目伞形科2年生草本植物,别名为归、秦归、西当归、岷当归等,通常以干燥的根入药,有补血活血、保肝润肺和促进免疫系统等作用[1],在抗肿瘤、调节子宫平滑肌、抗炎、抗损伤等方面发挥重要作用[2],在临床上也得到广泛应用。

腐烂茎线虫(Ditylenchus destructorThone,1945)在分类上隶属于动物界(Animal)、线虫门(Nematoda)、垫 刃 目(Tylenchida)、垫 刃 总 科(Tylenchidac)、茎线虫属(Ditylenchus),也称马铃薯茎线虫、马铃薯腐烂茎线虫、甘薯茎线虫,在全国温带地区都有发生,可为害90～120种植物,包括粮食作物、中药材、经济作物及杂草等[3],是破坏性最大的植物线虫之一[4]。当归茎线虫病俗称当归麻口病,病原为腐烂茎线虫(D.destructor),是当归上重要的病害之一,可使当归挥发性成分散失,药材质量下降,药用价值和商品价值降低[5]。据调查发现,在当归整个生育期内腐烂茎线虫均可危害,但以前期为主,当归受害后,一般年份减产在30%左右,随着长期迎茬和重茬种植,发病率可达85%,严重者高达100%,甚至绝收[1]。

本研究拟对采自青海省西宁市大同县和海东市互助县当归茎线虫群体进行形态观察和测量,基于r DNA-ITS序列构建系统发育树,以明确线虫种类,并分析其群体差异,以期为该地区腐烂茎线虫病的检疫、预防及控制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试线虫

分离自2019年11月青海省海东市互助县(E 102°2′18″,N 36°48′54″)、西 宁 市 大 通 县(E 101°43′26″,N 36°57′48″)当归麻口病样。

1.2 供试菌株

培养线虫用茄镰孢菌(Fusarium solani),由甘肃农业大学植物保护学院植物线虫学实验室提供。

1.3 线虫的分离

将采集的当归麻口病样,用自来水冲洗干净,晾干后拍照观察。采用改良贝曼漏斗法[6]分离线虫。取两层纸巾将切成小块的当归包裹放于漏斗中,漏斗下部用橡皮管接指形管,加水漫过纸巾包、浸透当归组织。静置10～12 h后,取下指形管对分离得到的线虫进行消毒、计数,备用。

1.4 线虫消毒

以3 000 r/min离心富集目标线虫,弃上清液;用0.5%次氯酸钠消毒2 min后,3 000 r/min离心,弃上清液;用无菌水冲洗2～3次;随后用混合消毒液(0.5%硫酸链霉素100μL、0.5%氨苄青霉素100μL、无菌水800μL)消毒10 min后,以3 000 r/min离心2 min,弃上清液;用无菌水冲洗3次,最后定容至1 m L,在4℃下保存,备用[7]。

1.5 线虫的形态学鉴定

1.5.1 线虫的杀死固定 参照谢辉等[8]方法,将目标线虫挑取至载玻片水滴中,手持载玻片在酒精灯火焰上方加热5～6 s,加热时注意观察线虫,当虫体突然伸直时,停止加热。

1.5.2 观察鉴定 在光学显微镜(蔡司,德国)下观察形态特征和测量特征值,参照谢辉[9]与段玉玺[10]的方法,采用de Man公式对形态数据进行分析,其中a=体长/体宽、b=体长/体前端至食道腺末端的距离、c=体长/尾长、c′=尾长/肛门处体宽、v=雌虫体前端至阴门的距离×100/雌虫体长和V′=雌虫体前端至阴门的距离×100/雌虫体前端至肛门距离。以刘维志等[11]对线虫分类特征的描述为参照,鉴定线虫种类。

1.6 线虫的分子生物学鉴定

1.6.1 线虫DNA提取 参照卓侃等[12]的方法略有改动,提取单条线虫DNA。挑取单条线虫于去离子水中清洗3遍,挑入装有10μL线虫裂解液(Worm Lysis Buffer,WLB)的200μL Buffer管中,以3 500 r/min离心3 min。反复冻融2次(液氮处理1 min,85℃水浴1 min),自然溶解后加入1μL蛋白酶K(1 mg/m L),将Buffer管放入预热的PCR仪中,65℃温育1 h,95℃下10 min,反应结束后即获得单条线虫DNA。随后以12 000 r/min离心5 min,上清液直接用于PCR扩增,最后于4℃保存,备用。

1.6.2 r DNA-ITS区段PCR扩增 采用线虫ITS区通用引物[13]TW81(5′-GTTTCCGTAGGTGAACCTGC-3′)、AB28(5′-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3′),对目标线虫ITS-r DNA基因序列进行PCR扩增。

PCR扩增采用25μL体系:DNA模板3μL,2×TaqPCR Master Mix 12.5μL,上、下游引物(10μmol/L)1μL,dd H2O补足到25μL。

PCR扩 增 程 序:94℃预 变 性4 min,94℃变性10 s,55℃退火20 s,72℃延伸1 min,38个循环后,72℃终延伸5 min,最终于4℃保存,备用。

取5μL PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,然后将PCR产物送往北京擎科西安分公司测序。使用软件Seq Man进行序列拼接,于NCBI进行BLAST比对,下载同源性较高的序列,以BI法构建系统发育树[14]:使用MAFFT比对分析后,用DAMBE检测饱和度,用软件Mr MTgui连接PAUP与Mr Model Test进行模型选择,最后使用Mrbayes以最佳模型构建系统发育树,用Fig Tree修正系统发育树。

1.6.3 r DNA-ITS区段PCR-RFLP分析 采用DdeⅠ、HinfⅠ、Tru9Ⅰ(MseⅠ)和SduⅠ4种内切酶,参照Subbotin等[15]的方法对线虫r DNA-ITS区PCR产物进行酶切。酶切采用20 μL体系,即PCR产物8μL,内切酶(10 U/μL)1μL,与内切酶相对应的Buffer 2μL,dd H2O 9μL。反应条件为37℃1.5 h。反应结束后,用2%琼脂糖凝胶(含0.5 mg/L核酸染色剂)分离扩增产物,用凝胶成像系统进行观察、拍照分析。酶切片段大小通过在线软件Wbcuter 2.0(http://www.firstmarket.com/cutter/cut2.html)获得,以Subbotin等[13]A-G型D.destructor作为对照。

2 结果与分析

2.1 线虫群体的分离

从青海省海东市互助县和西宁市大通县当归麻口病株中共分离到4个线虫群体,其中互助县分离得到3个线虫群体,分别编号为HZAI、HZA2、HZA3;大同县分离得到1个线虫群体,编号为DTA1。

2.2 当归茎线虫症状观察

腐烂茎线虫主要危害归头部分(图1-B)。一般从当归芦头开始发病,发病初期,根部无明显症状,后期主要表现为植株表皮粗糙,表皮纵裂呈褐色裂纹,深约2～3 mm,内部组织呈海绵状、木质化(图1-B)。严重时整株根部皮层组织干烂,从表皮至维管束全部呈褐色糠腐状(图1-C)。

图1 当归茎线虫病症状Fig.1 Symptoms of stem nematode disease of A.sinensis

2.3 线虫的形态学鉴定

2.3.1 特征描述 该线虫热杀死后虫体前端伸直,尾后端向腹部弯曲(图2-A,2-B)。线虫唇区低平,略有缢缩,口针细小,长约10～13μm,基部球明显,呈圆形。中食道球呈卵圆形,有膜瓣(图2-C)。食道狭部窄,食道腺自背面略覆盖肠的前端,排泄孔位于肠与食道连接处之前,半月体位于排泄孔前(图2-D)。尾圆锥形,末端稍圆(图2-F)。虫体侧线6条(图2-H)。雌虫阴门稍有突起,后阴子宫囊向肛门延伸(图2-G),约为阴门至肛门距离的3/4(图2-B,2-E)。雄虫交合刺略向腹部弯曲,交合伞向后延伸,至尾长的1/3处(图2-F)。

图2 青海当归线虫群体光学显微镜照片Fig.2 Light photomicrographs of nematode populations on A.sinensis in Qinghai

2.3.2 线虫形态特征测量值 通过形态特征和测量值比较,由表1、表2可知,与甘肃省当归腐烂茎线虫群体相比,青海省当归群体雄虫、雌虫体长均略小,雄虫尾长和c值(体长/体宽)略大,雌虫a值(体长/尾长)略大,其他测量值均基本一致。

表1 4个青海省当归线虫群体雄虫虫体相关测量值Table 1 Measurements of male of four nematode populations on A.sinensis from Qinghai province

表2 4个青海省当归线虫群体雌虫虫体相关测量值Table 2 Measurement of female of four nematode populations on A.sinensis from Qinghai province

2.4 分子生物学鉴定

2.4.1 线虫rDNA-ITS序列分析 经双向测序后拼接,群体HZA1、HZA2、HZA3和DTA1的r DNA-ITS序列长度依次为919 bp、916 bp、888 bp和919 bp,上传NCBI获得GenBank登录号依次为MW422776、MW422777、MW422778和MW048797。

经BLAST比对,发现HZA1、HZA2、HZA3和DTA1 4个群体与腐烂茎线虫种群的同源性较高,与中国腐烂茎线虫群体有着不同程度的相似性,其中HZA1的rDNA-ITS序 列与EF208210(甘薯C基因型群体)相似度为95.62%,ITS1序列长度相差2个碱基,且存在40个碱基差异;HZA2 rDNA-ITS序列与EF208213(甘薯D基因型群体)相似度达98.53%,ITS1区序列长度相差2个碱基,且存在12个碱基差异。HZA3、DTA1两个群体r DNA-ITS序列完全一致,与FJ911551(马铃薯B基因型群体)相似度为95.78%,但ITS1区序列长度与FJ911551相差2个碱基,且存在48个碱基差异。

2.4.2 线虫r DNA-ITS序列聚类分析 采用贝叶斯法构建ITS-r DNA系统发育树(图3),青海当归4个线虫群体与除A基因型之外的其他型腐烂茎线虫聚为一枝。HZA1线虫群体单独为一支;HZA2与F基因型腐烂茎线虫群体亲缘关系较近,与其他型腐烂茎线虫距离较远;DTA1和HZA3线虫群体聚为一支,且不属于其他已知类型。据此,将青海当归分离出的茎线虫群体鉴定为腐烂茎线虫(D.destructor),其基因型待定。2.4.3 r DNA-ITS区段PCR-RFLP分析 通过软件Wbcuter 2.0,用4种内切酶得到的片段数量与具体大小见表3。4个青海当归茎线虫群体的酶切片段分为3种类型,HZA1和HZA2各为1种,HZA3和DTA1为1种。其中DdeⅠ和SduⅠ酶切片段为3种片段;HinfⅠ酶切为4种片段;Tru9Ⅰ(MseⅠ)酶切片段类型为2类,即4种和5种不同片段,且不同类型片段存在长度差异。以4种内切酶DdeⅠ、HinfⅠ、Tru9Ⅰ(MseⅠ)及SduⅠ对青海当归线虫r DNA-ITS区PCR产物进行酶切验证,如图4所示,结果与使用软件Wbcuter 2.0酶切片段类型一致,但这4个当归的线虫群体与腐烂茎线虫其他群体酶切片段存在明显差异。

图4 青海省当归线虫群体与腐烂茎线虫r DNA-ITS区段PCR-RFLP结果Fig.4 PCR-RFLP results of rDNA-ITS haplotypes of D.destructor on A.sinensis from Qinghai province

表3 青海省当归线虫群体与腐烂茎线虫r DNA-ITS PCR产物酶切结果Table 3 Enzyme digestion results of rDNA-ITS PCR products of D.destructor on A.sinensis from Qinghai province

图3 基于r DNA-ITS序列贝叶斯50%多数原则腐烂茎线虫系统发育树(支点的数值为贝叶斯后验概率)Fig.3 Phylogenetic tree based on Bayesian 50% majority principle of r DNA-ITS sequence from D.destructor(the value of the pivot points is the Bayesian posterior probability)

3 讨论

本研究应用形态学结合分子生物学的方法对青海当归麻口病的病原线虫进行鉴定,将其定为腐烂茎线虫(D.destructor),这一结果证明腐烂茎线虫在青海省互助县和大通县已定殖,并侵染当归。

国内外关于腐烂茎线虫的研究发现,腐烂茎线虫种内存在明显的分化现象,在致病力方面,来自不同寄主的群体存在差异,但尚未划分出生理小种[14]。在抗药性方面,丁中等[16-17]研究表明,不同地区的腐烂茎线虫群体对不同类型杀线剂的抗性存在差异。在基因型方面,国内学者[18-21]根据r DNA-ITS片段长度将腐烂茎线虫群体分为A(或S)类型和B(或L)类型,而Subbtion等[15]根据r DNA-ITS二级结构将世界范围内不同寄主上的腐烂茎线虫群体分为A～G 7个基因型,中国腐烂茎线虫群体分为除G基因型之外的其他6个基因型,以A基因型群体为主。Arnika等[22]根据A～G不同基因型ITS1的主要差异区域设计特异性引物,通过特异性引物PCR扩增结果确定腐烂茎线虫的不同基因型。本研究对采集青海省当归麻口病上的4个线虫群体进行形态观察及测量,发现该4个群体形态特征与刘维志等[24]和谢辉[9]对腐烂茎线虫的描述基本一致,虫体测计值与王玉娟等[23]的描述存在差异,雄虫尾长与c值略大,雄虫c值较陈品三等[25]报道的略小,其他各形态测量值范围基本一致;整体测量值与刘维志等[24]、谢辉[9]、Goodey[26]和Thorne[27]的报道基本保持一致,符合腐烂茎线虫模式种的测量值范围,而形态测量值存在的微小差异,可能是由于地理环境差异或寄主不同造成的。通过r DNA-ITS序列系统发育分析,发现青海当归线虫群体与腐烂茎线虫群体聚为一支,其中HZA2群体与F基因型腐烂茎线虫群体亲缘关系较近,HZA1、HZA3和DTA1群体与其他型腐烂茎线虫亲缘关系都比较远。经r DNA-ITS区PCRRFLP分析,青海当归线虫群体与A-G基因型均

存在差异,不能归于A-G任何一基因型,对于其 基因型界定,有待进一步探索研究。

D.destructor是一种多食性、迁移性植物内寄生线虫,其寄主约100多种[7,28-29],包括当归、党参、人参和薄荷等药材。另外,青海当归腐烂茎线虫群体与甘肃定西、岷县等地当归群体、党参群体在致病性上是否存在差异,是否能侵染党参,以及不同地区当归腐烂茎线虫在耐寒性、耐盐性等其他生物学特性方面是否有差异尚待研究。