白燕燕,杜文彪,张彦芳,左存武

(甘肃农业大学 园艺学院,兰州 730070)

随着农业生产方式的不断优化和资源的逐步开发,生态环境受到严重影响。目前中国以实施农业清洁生产的方式,实现农业生产的清洁化和废弃物的高效资源化,改变农业生产现状,防止农业环境污染,保证农产品的质量安全。由于苹果枝条具有较高的木质素而出现木质化的现象,所以造成其降解速度缓慢,使果树修剪中产生的废弃枝条容易造成生态环境的污染[1],或导致剪口滋生病害[2]。

有研究发现利用纤维素酶对苹果枝条中纤维素类物质进行降解是最快速、经济、环保、有效的途径[3]。果树废弃枝条中含有大量有机物和营养物质,通过纤维素酶降解使这些有效成分能再次被树体吸收利用,以减少资源的浪费。近年来苹果腐烂病已成为一种严重的果树病害,在利用纤维素酶降解枝条的同时刺激其产生抵抗黑腐皮壳菌的物质,而这种物质在被树体吸收后能够自主产生抵御该病菌的抗性物质,从根源上减少树体病害的发生,提高果树生产率。产纤维素酶菌株主要有细菌和真菌[4],目前国内外已有关于利用生防菌降解苹果树枝条的研究报道[5],但对于菌株降解和生防作用的结合研究较少[6]。

试验初筛选出具有纤维素降解作用的细菌,测定该菌株降解纤维素的相关酶活力及其与黑腐皮壳菌对峙试验的生防潜力,观察其形态特征,并进行gyr A序列的16S r DNA分析鉴定。

1 材料与方法

1.1 菌株的分离纯化

1.1.1 试验材料 从甘肃农业大学园艺学院天水苹果种植试验基地采集显现降解情况的带菌枝条,黑腐皮壳菌(Valsa mali)由甘肃农业大学园艺学院实验室提供[7]。

1.1.2 试验试剂 CMC-Na、刚果红指示剂、3,5-二硝基水杨酸、水杨素等试剂均采购于北京索莱宝科技有限公司。而PremixTaq酶采购于北京宝日医生物技术有限公司。

1.1.3 试验仪器 体视显微镜购自卡尔蔡司光学(中国)有限公司,PCR仪器购自德国耶拿Biometra公司,酶标仪购自帝肯公司。

1.1.4 供试培养基 CMC刚果红培养基:(NH4)2SO42 g,MgSO4·7 H2O 0.5 g,KH2PO41 g,NaCl 0.5 g,CMC-Na 20 g,刚果红0.4 g,琼脂20 g,蒸馏水0.5 L,p H为7,121℃湿热灭菌20 min。

LB培养基:胰蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,NaCl 10 g,琼脂8.35 g。

复筛培养基:烘干苹果枝粉(过40目筛)40 g,麸皮粉2 g,NaNO33.5 g,NaNO20.14 g,Mn-SO4·H2O 0.42 g,KH2PO41.0 g,FeCl3·H2O 0.023 3 g,琼脂8 g,水0.5 L,用NaOH调节p H为7,121℃湿热灭菌20 min。

PDA培养基:去皮马铃薯200 g,蔗糖20 g,琼脂20 g,蒸馏水0.5 L,p H为7,121℃湿热灭菌20 min。

发酵培养基:2 cm枝条500 g,Na NO33.5 g,NaNO20.14 g,MnSO4·H2O 0.42 g,KH2PO41.0 g,FeCl3·H2O 0.023 3 g,琼脂8 g,水0.5 L。

产酶培养基:CMC-Na 15 g,酵母粉5 g,KH2PO42 g,p H为7,121℃湿热灭菌20 min。

1.2 细菌的初筛和复筛

初筛采用稀释涂布法对带菌部分枝段进行冲刷,进行单细胞分离[8],采用羧甲基刚果红培养基进行初筛[9],筛选出目的菌株。将已分离纯化的细菌接种在CMC-Na刚果红培养基上,37℃恒温下培养3 d。若菌株能产生纤维素酶,在培养的菌落边沿会出现明显的透明水解圈。

利用复筛培养基中接种初筛挑选出的产酶细菌,37℃条件下培养3 d后观察细菌的生长情况。通过以苹果枝条为生长碳源的复筛培养基的培养,复筛出生长情况良好的菌以用于后续对峙试验及酶活力的测定。

1.3 细菌的生防效果鉴定

采用平板对峙试验测定筛选获得菌株的生防效果[10]。将黑腐皮壳菌和复筛所获得的细菌等距离点接在LB培养基平板上,用仅接病原菌的LB平板作对照(CK),在37℃恒温条件下培养3 d,观察是否存在与病原菌的拮抗作用。

1.4 菌株最适生长特性测定

将筛选的细菌在恒定温度37℃且不同p H(5、6、7、8、9)的条件下和恒定p H=7且不同温度(25、28、30、32、35、37℃)条件下接种在复筛培养基平板上进行培养,测定培养4 d后细菌的菌落直径。

1.5 产酶活力的测定

1.5.1 细菌产酶培养 在复筛培养基上37℃静置培养4 d的纯化菌落的上下左右,利用打孔器各打5 mm的孔[11],将其接种于装有50 m L产酶培养基的三角瓶中,37℃、110 r/min振荡培养2 d用作种子液,在离心机4℃、12 000 r/min离心10 min除去菌体,所得上清液即为所需酶液[12]。

1.5.2 酶活力的测定 DNS法酶活力测定:将1 cm×6 cm的新华一号定量滤纸条的浓度作为0.5%CMC-Na溶液和0.5%水杨酸苷溶液的反应底物,并测定各溶液的酶活力。对产酶培养得到粗酶液进行DNS反应后,用分光光度计测定其在540 nm条件下的吸光值,根据标准曲线算得在反应体系中产生的葡萄糖浓度。在50℃条件下,将葡萄糖产出率为0.001 mg/min所需的酶量定义为一个纤维素的酶活力单位[13](U/m L)。计算公式如下:

酶活力单位=5.56×D×G(U·m L-1)

其中,D为反应体积的稀释倍数;G为吸光值对应葡萄糖量(mg)。

1.6 细菌纤维素降解能力的测定

将振荡培养7 d的产酶培养基中上清液作为种子液。在超净工作台中吸取10 m L种子液将其接种于50 g固体发酵培养基中,使用灭菌棒搅拌均匀,并使培养基变得湿润。接种后将开口密封,在湿度为60%、温度为37℃的条件下振荡培养30 d,每间隔一段时间取出培养的苹果枝条段观察其表面的颜色和腐烂变化。

1.7 基因鉴定

将筛选出的细菌置于液体LB培养基摇瓶中37℃、110 r/min培养4 d,吸取1 m L上清液,上清液即为DNA模板,进行gyr A序列r DNA 16S区域PCR扩增(PCR条件为:94℃预变性30 s,98℃变性10 s,58℃退火30 s,72℃延伸120 s,共35个循环,16℃保存。)、连T载体及挑斑验证送测。细菌gyr A序列所用的上、下游引物分别为:5′-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT-3′和5′-CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT-3′;测序结果进行NCBI官网BLAST序列比对。并下载其同源序列后使用软件MEGA 5.0的领接法(Neighbor-joining)构建系统发育树。

1.8 数据分析与处理

采用软件Origin 8.0将图形可视化,所有试验数据均用Microsoft Excel 2016进行整理并以“平均数±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 细菌的分离纯化和初筛

据单菌落形态、大小、颜色、表面光滑度和分布部位的不同,从分离获得的细菌中筛选和纯化得到具有降解作用的菌株。单皿菌落在琼脂固体培养基上变成单个细胞,再进行纯化培养,将其分别命名为X-1、X-2、X-3。用刚果红培养基染色细菌菌落,若菌落被染色则会出现透明圈。从试验结果中观察到,X-2菌落具有更明显(图1)的透明圈。根据出现透明圈的大小,挑选出具有产生纤维素酶的细菌,有透明圈的细菌即可初步认为其具有降解能力。再连续培养4 d后分别测量水解圈直径(D)和菌落直径(d),算出3次重复的平均值。结果表明,该菌落使用羧甲基刚果红染色后水解圈直径为57.25 mm±0.37 mm,菌落直径为12.81 mm±0.15 mm,D/d的值为4.47(表1)。

图1 细菌的生长情况及染色产生的透明圈Fig.1 Growth of bacteria and transparent circle produced by dyeing

表1 细菌羧甲基刚果红染色后的水解圈大小Table 1 Size of transparent circle after carboxymethyl Congo red staining

2.2 细菌的复筛

为了进一步证明菌株降解苹果枝条纤维的能力,采用复筛培养基对筛选的降解效果较好的细菌进行再筛。再以苹果枝条为生长碳源的固体复筛培养基上接种初筛的菌株X-2。结果表明,菌株X-2在复筛培养基上生长效果良好(图2),培养3 d后菌落润湿,直径大于8 cm。

图2 菌株X-2的复筛Fig.2 Re screening of strain X-2

2.3 细菌的生防效果鉴定

对峙实验中,在复筛所得菌株与黑腐皮壳菌共同培养后的PAD平板上[14],出现明显抑菌带(图3),表明其对黑腐皮壳菌生长具有明显的拮抗作用。

图3 菌株X-2对黑腐皮壳菌生长的影响情况Fig.3 Growth of Chaetomium nigrum under treatment of strain X-2

2.4 细菌的生长特性

在恒定温度37℃且不同p H(5、6、7、8、9)的固体复筛培养基上接种菌株X-2[15],静置培养4 d后测定菌落直径并进行统计(图4)。菌株X-2在p H为8时菌落直径最大,为46.32 mm±1.42 mm。结果表明:菌株X-2为弱碱性菌。

将接种在恒定p H=7且不同的温度下的菌株X-2于复筛培养基平板上培养4 d后,测定并统计该菌株菌落的直径。由图5可知,菌株X-2在温度为25～37℃间均可生长,但菌株最适生长的温度为30℃,其菌落直径最大,为36.42 mm±1.35 mm。

综上,从图4和图5分析可得,在温度为30℃、p H为8时的条件为菌株X-2的最适生长条件。

图4 不同p H下苹果枝条纤维降解菌株X-2的生长状况Fig.4 Growth of degrading strain X-2 in apple branch fiber under different p H values

图5 不同温度下苹果枝条纤维降解菌株X-2的生长状况Fig.5 Growth status of degrading strain x-2 in apple branches fiber at different temperatures

2.5 菌株的酶活力

以不同葡萄糖浓度(x)为横坐标、吸光度(y)为纵坐标绘制标准曲线(y=1.083 9x-0.001 1),R2=0.998 9,线性拟合度高。

维素酶对纤维素的水解功能可被滤纸酶活性替代。测量菌株酶活力的考察指标为滤纸酶活性,与β-葡萄糖苷酶活性共同进行菌株X-2酶活力的评估,而CMCase的酶活力只是作为测定菌株酶活力的参考指标。

将培养4 d后的菌株X-2摇瓶取样,2 d后取发酵液,测定菌株X-2的酶活力。由图6可知,发酵培养时,菌株X-2产生的CMCase和β-葡萄糖苷酶的酶活力在第8天均有活力高峰,分别为(8.36±0.02)U/m L和(8.63±0.64)U/m L,滤纸酶在发酵第10天活力值高达(12.78±0.03)U/m L。

图6 苹果枝条纤维降解菌株X-2不同培养时间的酶活力Fig.6 Enzyme activity of degrading strain X-2 in apple branch fiber at different culture time

2.6 细菌降解枝条的能力

将菌株X-2接种于装有苹果枝条段的发酵培养基中进行发酵。起初生长平缓,由于降解产物的代谢作用,使苹果枝条表层组织中的纤维素酶产增多,营养物质也增加。20 d时,枝条皮层开始变黑且逐渐降解;30 d时枝条切口出现裂缝,与发酵前比较,枝条段表面湿润有菌液且颜色较黑,说明苹果枝段部分被菌株X-2所降解(图7)。

图7 经X-2细菌发酵降解后的苹果枝段Fig.7 Apple branches degraded by X-2 bacteria

枝发酵培养50 d后,枝条表面更加湿润,细菌粘液增加,以失重法计算该菌株的枝条发酵培养降解率为12.36%±0.44%。

2.7 基因鉴定

2.7.1 形态观察 将发酵试验中的菌株X-2移接到LB培养基上,于37℃下培养2 d后观察到菌株X-2的菌落为浅黄色,不透亮,表面不光滑,有突起,边缘无规则(图8-A)。在电子显微镜下观察到其形态呈杆状,形成的内生芽孢为卵形,芽孢两头钝圆,芽孢囊没有膨胀,从中生到次端生,具有运动特性(图8-B)。

图8 菌株X-2的菌落形态及光学显微镜下的形态观察结果Fig.8 Colony morphology of strain X-2 and morphological observation under optical microscope

2.7.2 16S r DNA基因序列测定 PCR产物通过1%的琼脂糖凝胶电泳检测,获得约1 470 bp的DNA片段(图9)。对扩增出的目的片段测序后,将得到的序列输入NCBI数据库进行序列比对,再将菌株X-2与基因序列数据库中已知16S r DNA序列菌株两者的最高同源性进行对比,并下载与该细菌序列相近物种的同源序列,在多序列比对时采用Clustal X2,用MEGA 6.0软件构建发育树(图10)。

图9 X-2菌株16S r DNA片段扩增产物的电泳图谱(DL 5000 DNA maker)Fig.9 Electrophoretic map of 16S DNA fragment of strain X-2

结果表明,菌株X-2和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的16S r DNA序列属于同一类,可初步判断出菌株X-2属于芽孢杆菌的某一个亚种。再使用Blast同源序列检索,可以分析得出菌株X-2与解淀粉芽孢杆菌的亲缘关系接近。由图10可知,序列同源性为99%以上,可得出该生防菌株X-2为解淀粉芽孢杆菌。

图10 X-2菌株基于16S r DNA序列的系统发育进化树Fig.10 Phylogenetic tree of strain X-2 based on 16S r DNA sequence

3 讨论

纤维素的降解主要是凭借微生物自身产生的纤维素酶起作用[16],本试验主要以滤纸条作为反应底物,通过测定滤纸酶[17]、β-葡萄糖苷酶和CMC酶3种酶配合协作后的总酶活力来表示纤维素的酶活力[18]。现对解淀粉芽孢杆菌纤维素降解活性的研究较多。刘宇等[19]研究测得滤纸酶的活力为8.35 U/m L,β-葡萄糖苷酶的活力为2.3 U/m L,而在本试验中测得菌株X-2滤纸酶活力和β-葡萄糖苷酶活力高达(12.78±0.03)U/m L和(8.63±0.64)U/m L。景如贤等[20]测得CMCase酶活力为1.46 U/m L,而在本研究中CMCase酶活力约为(8.36±0.02)U/m L,菌株X-2产纤维素酶的效果相对于其他菌株的较好,且各酶的活力均比前人研究中的酶活力高,这表明该菌株对苹果废弃枝条的纤维素降解效果良好。

本研究结果表明,解淀粉芽孢杆菌可在降解过程中抑制废弃枝条中腐烂病的发生,也能够诱导树体产生抗性,激发植物的抗性反应,进一步增加树体从根源上抵御苹果腐烂病菌的能力。