赵雪光

（湖南医药学院口腔医学院，湖南 怀化 418000）

皮肤衰老（skin aging）是指皮肤出现功能衰老性损伤，皮肤防护、调节等能力减退，皮肤无法适应内外环境的变化，导致颜色、色泽、形态、质感等整体状况发生改变。皮肤衰老是内在因素和外在因素共同作用的结果，关于皮肤衰老的发生机制一直是研究热点。Bmi-1基因（B cell-specific MLV integration site-1）是Pc G家族成员之一，广泛参与细胞的增殖、分化与衰老；此外研究表明，其在多种肿瘤形成过程中起重要作用。基于此，本实验通过构建自然小鼠衰老模型，探讨Bmi-1在小鼠皮肤年龄相关衰老中的表达及作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 本实验经湖南医药学院实验动物伦理委员会批准。实验对象为健康昆明种小鼠，购买于南昌大学附属第一医院动物研究所[动物许可证号：SYXK（赣）2010-0002]，普通喂养。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 自然衰老小鼠模型构建参考文献资料，苏木精-伊红（HE）染色法与Masson三色染色检测皮肤表皮、真皮以及皮肤总胶原变化，判断是否建模成功。小鼠分为年轻组与年老组，每组5只。年轻组普通喂养8个月；年老组普通饮食喂养18个月。

1.2.2 HE染色检测小鼠表皮与真皮厚度 颈椎脱位致死各组小鼠后，切取背部皮肤组织放入4%多聚甲醛中浸泡，固定备用。标本常规脱水透明、石蜡包埋、连续切片，厚度为5 μm，然后切片经二甲苯脱蜡、浓度梯度酒精水化后浸入0.5%苏木素溶液中5 min，流水冲洗；用0.5%盐酸酒精分化10 s后，使用0.5%伊红水溶液复染4 min。切片常规脱水透明，中性树胶封片，显微镜下拍照，使用Image-Pro Plus软件测量表皮及真皮厚度。

1.2.3 Masson三色染色检测皮肤总胶原变化Weigert苏木素A、B液按照1∶1配比，浸没脱蜡后的切片，染色10 min，流水冲洗；1%盐酸酒精分化2 s，滴加丽春红酸性品红染液，染色10 min；磷钼酸溶液作用5 min后甩去，再滴加苯胺蓝染色5 min，加入1%冰醋酸溶液作用5 min后水洗。切片常规脱水透明，中性树胶封片，显微镜下拍照。总胶原阳性率=测量区真皮胶原染色面积/测量区真皮面积×100%。

1.2.4 蛋白印迹实验检测小鼠背部皮肤组织相关蛋白表达 喂养完成后，乙醚麻醉小鼠分离背部组织，根据小鼠质量加入适量RIPA裂解液裂解组织，冰上静置30 min，离心并提取蛋白。样品经蛋白质定量后，用10%～12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，然后将聚偏二氟乙烯膜与Bmi-1一抗（1∶800）、p16一抗（1∶1000）、p19一抗（1∶1000）于4 ℃冰箱中孵育过夜，次日加入二抗孵育1 h，化学发光法显色后，用Image Quant LAS-400mini曝光成像仪分析图像。

2 结果

2.1 两组小鼠皮肤衰老形态学变化 HE染色结果显示，年老组表皮厚度低于比年轻组（P＜0.05），真皮厚度也低于年轻组（P＜0.05）；Masson三色染色结果显示，胶原染色部分呈蓝色，年轻组小鼠胶原丰富，排列整齐，无明显断裂；年老组胶原明显减少，排列紊乱（P＜0.05），见图1、2及表1。

表1 两组小鼠表皮、真皮厚度及皮肤总胶原阳性百分率（）

图1 HE染色和Masson染色结果（×200）

2.2 皮肤中Bmi-1、p16、p19蛋白表达及相关性分析 年老组皮肤内Bmi-1表达低于年轻组（P＜0.05），p16与p19表达均高于年轻组（P＜0.05），见表2。Spearman相关性分析显示，Bmi-1的表达与p16呈负相关（r=-0.569，P＜0.05），与p19表达呈负相关（r=-0.389，P＜0.05）。

表2 两组小鼠Bmi-1、p16、p19蛋白的表达情况（）

图2 Masson三色染色结果

3 讨论

皮肤老化是由自然因素或非自然因素造成的皮肤衰老现象，往往表现为表皮变薄，真皮皱缩且厚度减少，镜下表现为胶原纤维变细、老化、排列紊乱、断裂等。皮肤组织随着时间的增加功能逐渐成熟活跃，到达某一年龄阶段就会开始出现退化。随着经济社会的发展，人们对于抗皮肤衰老的需求越来越大，但皮肤衰老的内在机制仍需进一步研究。因此，本实验通过构建小鼠皮肤自然衰老模型，探讨小鼠皮肤衰老有关机制，以期为抗皮肤衰老的研究提供理论基础。

Bmi-1基因属于聚硫蛋白复合体基因家族的成员之一，具有抑制转录的作用，被认为是一种原癌基因。作为第一个被发现的有功能的PcG成员，Bmi-1可参与造血、细胞周期调控以及衰老等过程。目前研究已经证实Bmi-1对下游通路的调节主要是通过减少氧化应激活性氧水平的产生，减少DNA双链断裂，促进其修复而调控氧化应激反应，从而参与DNA的损伤修复。此外Bmi-1基因广泛参与细胞的增殖、分化与衰老，并且在多种肿瘤形成过程中起着重要作用，其对于造血干细胞自我更新及分化潜能的维持也发挥重要作用。本实验通过构建小鼠自然衰老模型，检测小鼠皮肤衰老情况，并进一步研究Bmi-1基因在小鼠皮肤自然衰老中的作用。实验结果显示，HE和Masson染色检测皮肤形态学变化发现，年老组和年轻组比较，其表皮厚度降低，真皮厚度变薄，皮肤总胶原阳性百分率减少，提示小鼠皮肤衰老模型构建成功。研究发现Bmi-1基因能够通过p16和p19介导的信号通路调节神经干细胞和造血干细胞的增殖和凋亡，进而发挥生物学功能。本研究采用蛋白印迹实验检测Bmi-1、p16和p19在自然衰老小鼠皮肤中的表达，结果显示年老组皮肤Bmi-1表达下降，而p16、p19表达升高；Spearman相关性分析显示Bmi-1的表达与p16、p19表达呈负相关，提示Bmi-1表达的降低可能导致小鼠皮肤衰老的发生，其可能通过抑制细胞依赖性激酶抑制因子如p16、p19的表达而发挥抗皮肤衰老的作用。这也为Bmi-1的抗皮肤衰老作用提供理论基础。但是实验目前还只停留在动物实验的初级阶段，Bmi-1的具体调控机制以及细胞学信号通路的变化未有深入研究，这也是今后需要深入的方向。

综上所述，Bmi-1在衰老小鼠皮肤中表达降低，其机制为调控p16和p19的表达，抑制小鼠皮肤衰老。