庄孝飞，顾文佳，顾晟琳

（上海市质量监督检验技术研究院，上海 200233)

南瓜（）是人们生活中最常见的蔬菜之一，具有丰富的营养价值和较高的药用价值。近年来，国内外学者对南瓜的化学成分、药理作用和临床应用进行了较多的研究，证明南瓜含有多种药理活性成分，是开发各种保健食品和药品的宝贵资源。王胜杰等利用气相色谱法测定出南瓜中含有丰富的肌醇，其具有改善细胞营养，降低血脂，抑制胆固醇的生成及动脉硬化等作用。孔庆胜等研究表明，南瓜多糖是较理想的能改善脂类代谢的食疗剂。徐国华等研究表明，南瓜具有一定的抗癌及升高血浆白细胞、淋巴细胞的作用和增强红细胞免疫吸附的功能。南瓜作为一种防治糖尿病的特效营养保健食材，备受人们的青睐。

我国是南瓜的主产国之一，但是新鲜南瓜水分含量较高、不易储存，若加工销售不及时、储存运输条件不当，都会造成南瓜的腐烂和损耗。南瓜腐烂主要由微生物引起，发霉腐烂是影响南瓜品质的主要因素之一。机械伤害，更易发生品质劣变和微生物侵染。因此，安全、卫生地储存南瓜，同时有效保持其营养价值是目前的研究热点。

有效氯是当前最常用的消毒剂之一，采用有效氯对南瓜表面进行消毒是一种简便、经济、有效的采后处理方法；然而，目前尚缺乏对消毒剂浓度和消毒时间的研究证据。本研究将探索次氯酸钠溶液最佳有效杀菌浓度和浸泡时间，并通过回接侵染试验确认优势霉菌，验证最佳有效氯浓度的次氯酸钠溶液的杀菌效果，以期为降低南瓜表面微生物侵染风险，延长南瓜的贮藏时间提供依据，同时为南瓜等新鲜果蔬的前处理手段提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料与设备

供试南瓜品种为“皇家一号”（上海曹野农业发展有限公司种植）。试剂有：次氯酸钠滴定溶液（0.5 mol/L，北京盛世康普化工技术研究院）；营养琼脂培养基、马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）、孟加拉红培养基、沙氏培养基（北京陆桥技术股份有限公司）；高盐察氏培养基（广东环凯微生物科技有限公司）；Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒、SanPrep柱式胶回收试剂盒等分子生物学试剂（生工生物工程（上海）股份有限公司）。

设备有5430R型台式冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；KBF240霉菌培养箱（德国Binder公司）；VERITI梯度PCR仪（美国ABI公司）；Geldoc XR＋型凝胶成像系统（美国Biorad公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 次氯酸钠溶液对新鲜南瓜表面的杀菌效果试验

1.2.1.1 新鲜南瓜表面的菌落总数统计 选取27个新鲜南瓜，分别标记序号后，用棉棒反复涂抹南瓜尾部表面，涂抹面积为10 cm。将棉棒置于10 mL无菌生理盐水中，混匀后进行10倍梯度稀释，分别吸取0、10、10、10稀释液1 mL于无菌平皿中，倾注营养琼脂培养基，冷凝后倒置于37 ℃恒温培养箱中培养（48±2）h，计数菌落，统计每个南瓜表面10 cm内菌落总数值，作为对照。

1.2.1.2 消毒新鲜南瓜表面的菌落总数统计 将上述27个涂抹过的南瓜进行消毒处理，每3个南瓜为1组，共9组。采用有效氯浓度为50、200、1 000 mg/kg的次氯酸钠溶液，分别浸泡3、5、10 min。将浸泡后的南瓜晾干，分别在1.2.1.1所述南瓜10 cm表面相近部位（尾部）再次用棉棒反复涂抹10 cm大小的区域，检测菌落总数，方法同1.2.1.1。

计算杀菌率，杀菌率＝（新鲜南瓜表面的菌落总数－消毒南瓜表面的菌落总数）／新鲜南瓜表面的菌落总数×100%。

1.2.2 腐烂南瓜中优势霉菌的分离与纯化

将从已腐败的南瓜中分离出的各种霉菌分别接种至PDA培养基和孟加拉红培养基上，28 ℃培养5～7 d，从中挑取5株具有典型特征的腐败霉菌进行分离纯化。用无菌剪刀在新鲜南瓜表面上剪出1 cm×1 cm大小的伤口，将分离纯化的霉菌分别回接至南瓜表面大小为1 cm ×1 cm的伤口上，以接种无菌水为对照，常温贮藏3～5 d，观察伤口处的霉菌生长情况，确定优势腐败霉菌。将分离的优势霉菌接种于高盐察氏培养基上，28 ℃培养3～7 d，观察并记录霉菌在培养基上的形态特征，包括菌落特征以及菌丝体生长状况等。同时，提取优势腐败霉菌分离株DNA，通过PCR技术获得优势腐败霉菌rDNA-ITS序列，并使用NCBI进行序列相似度比对，从而鉴定优势霉菌种类。

1.2.3 最佳杀菌条件对腐烂南瓜中优势霉菌的最佳杀菌效果

将优势霉菌g1、w2、w3分别接种至PDA培养基上，28 ℃条件下培养5～7 d，用0.9%的生理盐水将孢子洗至无菌三角瓶中（内装灭菌玻璃珠），摇匀、过滤出菌丝体，分别制备浓度为2.0×10、2.6×10、6.0×10个/mL的孢子悬液。取已消毒的9个新鲜南瓜，每3个南瓜为1组，共3组。分别标记序号后，在南瓜表面划出10 cm大小的区域，将0.1 mL孢子悬液均匀涂至该区域上，晾干；再经1.2.1方法中得出的最佳浓度次氯酸钠溶液和浸泡时间处理后，晾干，用棉棒反复涂抹该区域，回收南瓜表面的孢子。将棉棒置于10 mL无菌生理盐水中，混匀，并进行10倍梯度稀释，取0、10、10、10稀释度各1 mL于无菌平皿中，倾注沙氏培养基，冷凝后28 ℃下培养5～7 d，计数霉菌。计算杀菌率，杀菌率＝（初始涂至南瓜表面的霉菌孢子数值－消毒处理后回收南瓜表面的霉菌孢子数值）／初始涂至南瓜表面的霉菌孢子数值×100%。

1.3 数据统计分析

杀菌率作为计量资料采用mean±SD进行统计描述。考虑到3次平行试验条件结果的相关性，同一浸泡时间不同有效氯浓度进行比较，同一有效氯浓度不同浸泡时间进行比较，采用线性混合模型（linear mixed model）进行分析，得到最佳杀菌条件（有效氯浓度和浸泡时间）组合。采用SAS 9.4统计软件进行差异分析。

2 结果与分析

2.1 次氯酸钠溶液对南瓜表面的杀菌效果

如表1所示，在不同浸泡时长下，随着有效氯浓度的升高，杀菌率也随之升高（＜0.05）。在10 min浸泡时长下，有效氯50 mg/kg与有效氯200 mg/kg溶液的杀菌率差异的值处于0.05临界（＝0.044 9），有效氯200 mg/kg与有效氯1 000 mg/kg溶液的杀菌率无统计学差异（＝0.705 7）。在有效氯200 mg/kg和有效氯50 mg/kg浓度下，随浸泡时间的延长，杀菌率也随之升高（＜0.05），在有效氯1 000 mg/kg浓度下，杀菌率达到高峰，不同浸泡时间下的杀菌率差异无统计学差异（＞0.05）。兼顾食品营养品质和感官质量，在达到一定杀菌效果的同时尽量采用较低浓度次氯酸钠溶液；因此，本试验确定最佳消毒条件为有效氯200 mg/kg的次氯酸钠溶液浸泡10 min，南瓜表面的杀菌率达到99.53%。

表1 不同有效氯浓度、不同浸泡时间南瓜表面杀菌率

2.2 腐烂南瓜中优势霉菌的分离与纯化

经培养后，腐烂南瓜表面上的霉菌在2种培养基上生长出形态各异的霉菌。从中挑取5株具有典型特征的腐败霉菌分离纯化并进行回接后，有3株霉腐的菌丝生长旺盛，侵染较快，1个月后南瓜伤口处已腐败溃烂（图1），由此确认这3株霉菌为优势腐败霉菌，其形态特征如表2所示。

图1 优势腐败霉菌回接侵染试验

分别以菌株g1、w2、w3基因组DNA为模板，采用真核生物ITS通用扩增引物进行特异性扩增，获得609、565、586 bp的ITS片段的PCR产物，经电泳检测，3个分离株ITS基因扩增片段如图2所示。N C B I序列相似度比对结果如表2所示，鉴定得出3株霉腐，分别是黑曲霉（）、西瓜蔓枯病菌（）、芽枝霉属（）。

图2 优势菌株g1、w2、w3的ITS序列电泳检测结果

表2 优势腐败霉菌的形态特征、ITS序列鉴定及NCBI比对结果

2.3 最佳杀菌条件对腐烂南瓜表面优势霉菌的杀菌效果

如表3所示，在有效氯200 mg/kg的次氯酸钠溶液浸泡10 min的杀菌条件下，对腐烂南瓜表面优势霉菌g1、w2、w3的杀菌率均在99.1%及以上，杀菌效果显著。

表3 最佳杀菌条件对优势霉菌的杀菌率

3 结论与讨论

南瓜的保鲜储存问题一直是国内外学者关注的重点，研究表明南瓜最佳储存环境为10 ℃左右，湿度不超过80%，通风、防碰伤。一旦出现伤口，则容易腐烂。本研究发现，南瓜最先出现腐烂的部位一般都在瓜蒂和尾部，还有采摘运输中形成的伤口位置。因瓜蒂和伤口有破损，微生物易侵入，外加湿热的储存环境，会加速南瓜的腐烂。在采收后及时对南瓜表面进行消毒，去除有害易致腐微生物，将是简单有效且经济实用的延长南瓜贮藏时间的方式之一。

本研究表明，采用次氯酸钠溶液对南瓜表面消毒，能够有效杀灭南瓜表面大部分微生物。经线性混合模型分析，并考虑到食品营养品质和感官质量，南瓜采后处理尽量在达到一定的杀菌效果的同时采用低浓度消毒溶液，因此得到杀菌条件组合为：有效氯200 mg/kg的次氯酸钠溶液浸泡10 min，对南瓜表面的杀菌率可达到99.53%。这与方宗壮等的研究结果相似，经200 mg/kg次氯酸钠溶液处理的鲜切菠萝能更好地保持产品品质，延长贮藏时间。

刘程惠等从腐败的苹果中分离出优势腐败霉菌黑曲霉。陈悦等从发病西瓜叶片上获得334株西瓜蔓枯病菌。何祎对邳州地区霉腐蒜头的微生物进行了分离鉴定，确定腐霉的种类主要为芽枝霉菌、黑霉菌等。本研究从腐败南瓜中分离纯化出的优势霉菌为黑曲霉（）、西瓜蔓枯病菌（）和芽枝霉属（），可引起多种食品腐败变质，这为后续食品贮藏中腐败微生物的防治提供了有力的信息支持。将分离得到的3种优势霉菌分别接种至新鲜南瓜后，经本研究探索出的最佳杀菌条件进行处理，杀菌率依然在99.1%及以上，证明该最佳杀菌条件对南瓜表面的腐败霉菌能够起到很好的消杀作用。

综上，有效氯200 mg/kg的次氯酸钠溶液浸泡10 min是本研究探索出的最佳杀菌条件；该杀菌条件对腐败霉菌的杀菌效果得到了验证，能够对南瓜表面微生物包括细菌和腐败霉菌起到良好的消杀作用，可作为采后南瓜表面杀菌的有效手段。