张驰昊 高冬梅 郑迪 轩永丽 李文华,

(徐州医科大学 1心血管病研究所，江苏 徐州 221000；2附属医院)

随着冠心病的诊断、介入和放射诊疗技术的发展，对比剂的广泛使用，由对比剂引起的急性肾损伤(CI-AKI)逐渐成为医源性肾衰竭的常见原因之一〔1〕。同时，CI-AKI、支架内血栓和支架内再狭窄已成为经皮冠状动脉介入(PCI)患者术后的三大并发症〔2〕，也是PCI术后1年死亡、心肌梗死和靶血管重建风险的独立预测因素〔3〕。CI-AKI的发生增加患者的医疗负担，病情严重者可发展为慢性肾功能衰竭，甚至需要肾脏替代治疗，严重威胁患者预后。

CI-AKI的发病机制未完全明确，多种因素可能参与了CI-AKI的发生发展。大多数学者认为，对比剂引起氧自由基损伤〔4〕、肾脏血流动力学改变〔5〕及对比剂的直接肾小管毒性损伤〔6〕是其重要机制。此外，还可能与肾小管阻塞、内皮祖细胞数量减少、炎症反应和免疫机制相关。本研究旨在探讨虾青素(AST)在碘海醇(CM)诱导的HK-2细胞损伤中的保护作用，并探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1.1主要材料 人近端肾小管上皮细胞株(HK-2)；AST(sigma)；CM(扬子江药业有限公司)；胎牛血清(四季青，中国)；DMEM/F12( Hyclone,美国)；N-乙酰半胱氨酸(NAC，阿拉丁公司，中国)； 二喹啉甲酸(BCA)蛋白试剂盒、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(AnnexinV-FITC/PI)细胞凋亡试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)；核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白(NLRP)3抗体(美国Cell Signaling Technology公司)；半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(caspase-1)抗体(美国Proteintech公司)；人白细胞介素(IL)-1β、人IL-18酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(美国ABclonal Technology公司)；β-actin抗体(美国Proteintech公司)。

1.2细胞培养与分组 HK-2细胞株在含10%胎牛血清、0.1%青霉素和链霉素的DMEM/F12培养基中培养，当细胞长至70%～80%时，换不含血清的培养基继续培养24 h，使细胞同步于静止生长期(G0/G1期)后随机分组：空白对照组(Con组)、溶剂对照组(DMSO组)、AST对照组(AST组)、CM组、AST预处理组(AST+CM组)、N-乙酰半胱氨酸预处理组(NAC+CM组)。

1.34，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)DNA荧光染色观察细胞核形态 将生长于24 孔培养板中的大鼠肾小管上皮细胞，用磷酸盐缓冲液(PBS)轻洗3次，4%多聚甲醛(溶于0.1 mol/L PBS，pH7.4)室温固定15 min后，再次用PBS轻洗3次×5 min，避光条件下加入3 ml DAPI(荧光性的DNA结合染料，用含0.2%Triton的PBS溶解)染色5～10 min，PBS冲洗3遍×5 min。在Olympus荧光显微镜上，以400 nm为激发光，455 nm发射光观察。

1.4Annexin V-FITC/PI 双染流式细胞仪检测细胞凋亡 用2 ml PBS轻轻润洗培养皿中的细胞，去除PBS。将细胞重新悬浮于之前的培养基中或预冷的1×结合缓冲液中使其细胞浓度大约为1×106细胞/ml。取500 μl细胞悬液(5×105个细胞)至1个干净的离心管中，离心1 000 r/min×5 min，去上清，加入500 μl PBS洗涤细胞1次，离心，去上清。再加入500 μl的1×结合缓冲液洗涤细胞1次，离心，去上清；加入100 μl 1×结合缓冲液重悬细胞后加入5 μl Annexin V-APC室温避光反应15 min。加入500 μl的1×结合缓冲液洗涤细胞1次，离心，去上清；加入200 μl 1×结合缓冲液重悬细胞后加入5 μl PI。将样品在1 h内用流式细胞仪检测分析。

1.5流式细胞仪检测细胞内活性氧(ROS)水平 以细胞接种密度为4×105/ml，接种于6孔板中，培养24 h至细胞贴壁。根据分组用相应药物处理细胞，Con组、DMSO组无特殊处理；CM组加入Rosoup 1 μl+1 ml活性氧荧光探针(DCFH-DA)；实验各组处理时间到后，除Con组、DMSO组外，各实验组加入终浓度为10 μmol/L DCFH-DA 1 ml，37℃、5%CO2培养箱内培养30 min。弃培养基，无血清培养基洗3遍×5 min，充分去除未进入细胞的DCFH-DA。胰酶消化收集细胞，上流式细胞仪检测ROS，激发光488 nm，发射光525 nm。

1.6Western印迹检测蛋白表达水平 提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度后，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转膜后室温下封闭，用特异性抗体进行免疫杂交检测，β肌动蛋白(β-actin)作为内参照，化学发光剂显色，最后对目的条带进行扫描密度分析。每组重复3次。

1.7酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞上清液IL-1β、IL-18分泌水平 以细胞密度为2×105个/孔，接种到12孔板上，每组设6个复孔，分组及转染条件同前。分别于转染后1、3、5 d收集细胞上清，应用ELISA，检测各组细胞上清中IL-1β、IL-8表达情况。实验步骤按照ELISA试剂盒说明书进行。

1.8统计学方法 采用Graphpad Prism5.0 软件进行χ2检验，t检验，方差分析。

2 结 果

2.1CCK-8检测各组细胞增殖活性 与Con组〔(100.00±9.21)%〕相比，DMSO组AST组差异无统计学意义〔(98.41±7.03)%，(96.05±5.33)%，P>0.05〕；CM组细胞的增殖活性明显下降〔(51.50±3.06)%，P<0.05〕。AST+CM组〔(87.17±4.62)%〕和NAC+CM组HK-2细胞增殖活性较CM组明显增加〔(90.01±4.83)%，P<0.05〕。与NAC+CM组相比，AST+CM组HK-2细胞增殖活性差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2DAPI 荧光染色观察各组细胞核形态 采用DAPI DNA 荧光染色的方法观察细胞核形态，DAPI可以和双链DNA的A碱基相结合，DAPI染色后细胞核会发出淡蓝白色的荧光。正常细胞的细胞核似于圆形，边缘清晰，染色均匀且淡染。早期凋亡细胞呈现核固缩，核染色加深；晚期凋亡细胞表现为核碎裂成大小不等的圆形小体，并被细胞膜所包绕，即凋亡小体，细胞核DAPI染色荧光较强。Con组、DMSO 组和AST组，细胞核近似于圆形，边缘清晰，染色均匀且淡染，未见凋亡细胞。CM组细胞较Con组状态差，可见大量细胞出现核固缩、核深染，固缩的核呈高亮状态，部分细胞可见核裂解，为凋亡细胞。与CM组相比，AST组核固缩、核深染状态明显改善，凋亡细胞显著减少；NAC+CM组核固缩、核深染状态也明显改善，凋亡细胞减少。观察AST+CM组与NAC+CM组中凋亡细胞比例相似。AST+CM组与NAC+CM组比较无明显差异。见图1。

2.3各组细胞ROS的表达 用FCM检测平均荧光强度来表明肾小管上皮细胞内ROS的表达水平，实验结果显示：与Con组(602.14±70.09)相比，DMSO 组(663.76±93.53)和AST组ROS表达水平(506.56±81.77)无明显变化(P>0.05)；与Con组比较，CM组肾小管上皮细胞内ROS表达显著升高(2 494.33±402.56，P<0.05)。与CM组相比，AST+CM组(1 091.97±28.87)及NAC+CM组细胞内ROS(887.29±179.45)均明显降低(P<0.05)。AST+CM组与NAC+CM组肾小管上皮细胞内ROS 表达量差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4AnnexinV/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率 与Con组〔(2.32±0.61)%〕相比，DMSO组〔(2.58±0.97)%〕及AST组肾小管上皮细胞的细胞凋亡率〔(2.81±0.79)%〕无明显变化(P>0.05)；与 Con组比较，CM组细胞凋亡率〔(18.53±3.52)%〕显著升高(P<0.05)。 AST+CM组〔(8.24±2.48)%〕、NAC+CM组细胞凋亡率〔(7.55±1.27)%〕较 CM组显著降低(P<0.05)。 AST+CM组和NAC+CM组进行比较，肾小管上皮细胞的细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

2.5Western印迹检测各组NLRP3炎性小体相关蛋白表达水平 与Con组相比，DMSO组和AST组肾小管上皮细胞中NLRP3、caspase-1蛋白表达无明显变化(P>0.05)；CM 组 NLRP3、caspase-1蛋白表达与Con组比较均显著增加(P<0.05)。 与CM组比较，AST+CM组NAC+CM组NLRP3、caspase-1蛋白表达明显减少(均P<0.05)。AST+CM组与NAC+CM组NLRP3、caspase-1蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。见表1、图3。

图1 各组HK-2细胞DAPI荧光染色(×200)

图2 Annexin V/PI染色后流式细胞仪检测细胞凋亡率

表1 各组HK-2细胞 NLRP3、caspase-1蛋白表达、IL-1β、IL-18表达比较

1～6：Con组，DMSO组，AST组，CM组，AST+CM组，NAC+CM组图3 各组HK-2细胞 NLRP3、caspase-3蛋白的表达

2.6ELISA KITS测各组细胞IL-1β、IL-18表达 与Con组相比，DMSO组、AST组肾小管上皮细胞中IL-1β、IL-18表达量无明显变化(P>0.05)；与Con组相比，CM组肾小管上皮细胞中IL-1β和IL-18表达量显著增加(P<0.05)。 AST+CM组肾小管上皮细胞中IL-1β和IL-18表达量较CM组明显减少(P<0.05)；NAC+COM组肾小管上皮细胞中IL-1β和IL-18表达量较CM组也明显减少(P<0.05)。见表1。

3 讨 论

CI-AKI是指血管内途径应用含碘对比剂后出现的急性肾功能损害〔7〕。最常使用的临床诊断标准由 2003 年及 2008 年欧洲泌尿生殖放射协会确定，即使用对比剂后48～72 h内SCr的绝对值升高大于44.2 μmol/L(0.5 mg/dl)或相对于基线水平升高大于25%，并且排除其他导致肾功能急性恶化的原因〔8〕。应用对比剂后，血肌酐通常在对比剂使用后1～2 d开始升高，3～5 d达到高峰，7～10 d恢复到正常〔9〕。

CI-AKI的危险因素包括：基础肾功能不全、糖尿病、高龄、高血压、高胆固醇血症、急性心肌梗死、血容量减少、高渗对比剂及对比剂的使用剂量等。其中基础肾功能不全的患者CI-AKI的发生率明显升高，尤其是合并糖尿病的患者〔10〕。CI-AKI的主要发病机制主要包括：(1)肾脏血流动力学改变；(2)氧化应激；(3)细胞凋亡；(4)造影剂的直接细胞毒性；(5)免疫炎症反应等。一旦发生CI-AKI，不仅会增加患者肾衰竭和死亡的风险〔3,11〕，而且会显著延长患者的住院时间，增加经济负担〔12〕。

AST是迄今为止发现的自然界中抗氧化性最强的物质。AST被证明具有抗氧化活性，可作为自由基的清除剂和ROS的猝灭剂〔13～15〕。在动物实验和人体研究中还表现出有效的抗炎作用和抗凋亡作用。氧化应激、细胞凋亡和免疫炎症反应是CI-AKI的常见病理生理学特征，因此AST可能在这种情况下具有潜在的治疗作用。许多研究证明，AST对各种肾脏疾病具有预防作用〔16～20〕。最近的研究表明，AST的抗氧化活性在各种肾毒性药物如黏菌素，顺铂和次氮基三乙酸铁诱导的急性肾损伤中起保护作用〔21～23〕。Kim等〔24〕证实，在AST可以通过清除自由基减轻高浓度葡萄糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡和炎症反应。与本研究一致，本研究结果显示，CM损伤后，细胞增殖活性受到抑制，AST预处理后可以改善细胞增殖活性，缓解CM诱导的HK-2细胞损伤。研究结果证实，细胞凋亡和炎症反应机制参与了CM诱导的HK-2细胞损伤的发生；AST可以通过改善细胞凋亡和炎症反应，减轻CM诱导的HK-2细胞损伤。

NLRP3能够通过细胞凋亡相关斑点样蛋白(ASC)与caspase-1组成多蛋白复合体，即NLRP3炎症小体〔25〕。NLRP3炎症小体在机体受到外界刺激时能够感受多种微生物产物和代谢性应激使NLRP3 炎症小体激活，进而激活caspase-1，由活化的caspase-1作为效应蛋白诱导下游的细胞凋亡和炎症反应〔26,27〕。人体内多种细胞内均有 NLRP3 炎症体的表达，如单核细胞、树突细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、上皮细胞和成骨细胞细胞质〔28,29〕。研究显示，NLRP3炎性小体及其介导的下游细胞凋亡和炎症反应，在CI-AKI的发生发展中起着重要作用〔30,31〕。对比剂可以作为PAMP激活NLRP3炎症小体，对比剂干预后肾组织细胞内的NLRP3表达水平显著提高，参与肾组织的炎症反应，从而引起肾脏组织细胞的损伤〔32〕。在NLRP3基因敲除的小鼠中对比剂引起的肾损伤显著减轻。这提示，NLRP3炎症小体可以作为防治对比剂急性肾损伤药物研究的重要靶点〔30〕。本研究与上述研究结果一致，本实验结果证明，AST是通过抑制NLRP3炎症小体信号通路发挥作用的。

ROS目前被认为是激活NLRP3炎症复合物的关键分子之一，ROS可以通过特有的途径诱导NLRP3炎症小体的组装和激活〔33～35〕。AST作为自然界最强的抗氧化剂，其抗氧化性是维生素E的数百倍，AST能够有效抑制ROS产生〔36〕。本实验研究结果显示：CM组HK-2细胞内 ROS 含量显著升高；AST预处理后HK-2细胞内ROS活性明显降低。实验结果初步证实我们的推测，AST是通过抑制ROS的产生实现对NLRP3炎症小体信号通路的抑制作用，从而减轻碘海醇诱导的人HK-2的炎症反应和细胞凋亡损伤。为了进一步证实，我们应用了ROS的特异性抑制剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)抑制ROS的产生。本实验结果进一步证实了AST是通过抑制ROS的产生，从而抑制NLRP3炎症小体及其下游的细胞凋亡和炎症反应，减轻CM诱导的HK-2的损伤。