王东鹏，叶 诚

（武汉海关技术中心，湖北武汉 430050）

磺胺类药物（sulfonamides，SAS）是含有对氨基苯磺酰胺结构的人工合成的抗菌药物[1-2]，因抗菌谱广[3]、抗菌效应强、成本低[4]以及化学性质稳定等优点而广泛应用于临床及畜牧业和养殖业[5-6]。然而，磺胺类药物在体内代谢缓慢，长期大量使用容易导致该类药物在动物体内残留，进一步通过食物链在人体内蓄积，引发肾毒性、胃肠道出血、再生障碍性贫血[7]、过敏反应、以及细菌耐药性和致癌性等[4,8-10]，严重危害人类健康。许多国家对动物源性食品中磺胺类药物的最大残留量有明确规定，国际食品法典委员会（Codex Alimentarius Commission，CAS）规定动物源性食品中磺胺类药物最大残留量为100 μg/kg[11]。我国在GB31650-2019《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》中规定，除牛奶外，动物源性食品中磺胺类药物最大残留量为100 μg/kg[12]。值得注意的是，尽管多个国家和地区明确规定磺胺类药物的最大残留量，但农户为追求更高的商业价值，磺胺类药物的滥用现象仍然存在。因此，建立高效、准确、快速的磺胺类药物检测方法对食品安全至关重要。

目前，高效液相色谱-串联质谱法、毛细管电泳法、高效液相色谱法、放射性免疫法、免疫传感器法、酶联免疫吸附法和胶体金免疫层析法是磺胺类抗菌药物常用的检测方法[4,13]，高效液相色谱-串联质谱法因具有灵敏度高、准确性好等优点，是目前动物源性食品中抗生素残留最主要的检测方法。样品前处理方法直接影响检测结果，磺胺类药物常用的提取溶剂为乙腈、二氯甲烷或混合溶剂，在提取溶剂中加入酸或碱可增加提取效果。QuEChERS 净化法[14]、固相萃取法[15-16]、固相微萃取法、基质固相分散法[17]、加压液体萃取法、免疫亲和色谱法[18]和液液萃取法[19]是常用的提取方法。动物源性食品常含有大量脂肪、蛋白质等大分子化合物，对样品检测干扰较大，传统的前处理方法操作复杂、耗时长、溶剂消耗大，提取液中较高含量的脂肪和蛋白质仍然是其主要缺点[19]，新型增强型脂质去除净化柱（Captiva EMRLipid）通过体积排阻和疏水作用，可有效地去除脂质，最大程度地减少分析物的流失，方法的可靠性和耐用性显著提高。目前增强型脂质去除固相萃取净化柱在动物源性食品中磺胺类药物检测中应用较少。

本研究拟采用新型增强型脂质去除固相萃取柱结合高效液相色谱-串联质谱法建立鲈鱼中18 种磺胺类抗菌药物高效、灵敏、快速的检测方法，旨在为鲈鱼等动物源性食品中磺胺类抗菌药物的快速检测提供新的依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大口黑鲈鱼样品 购于超市；磺胺醋酰、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺吡啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺噻唑、磺胺氯哒嗪、磺胺甲噁唑、磺胺异噁唑、磺胺嘧啶、磺胺喹恶啉、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺苯吡唑、苯甲酰磺胺（浓度100 μg/mL） 天津阿尔塔科技有限公司；甲氧苄啶（浓度100 μg/mL）北京坛墨质检科技有限公司；2 种内标（磺胺间二甲氧嘧啶-D6 和磺胺邻二甲氧嘧啶-D3） 纯度≥98.9%，上海安谱璀世标准技术服务有限公司；甲醇色谱纯，武汉弗顿控股有限公司；乙酸乙酯 色谱纯，美国Thermo Fisher Scientific 公司；乙腈 色谱纯，美国Honeywell 公司；甲酸铵 色谱纯，德国CNW 公司；甲酸 分析纯，广东光华科技股份有限公司；氯化钠、无水硫酸钠 分析纯，国药集团化学试剂有限公司；实验用水 为超纯水。

Agilent1200 高效液相色谱仪配二元高压泵、自动进样器和柱温箱，Captiva EMR-Lipid 3 mL/300 mg固相萃取柱 美国Agilent 公司； Poly-Sery MCX 3 mL/60 mg 固相萃取柱、CNW Athena C18-WP 色谱柱（2.1 mm×100 mm，3 μm） 德国CNW 公司；AB SCIEX API 4000Q 质谱联用系统配电喷雾离子源（ESI） 美国AB SCIEX 公司；Neofuge1600R 台式冷冻离心机 上海力申科学仪器有限公司；BS210S万分之一电子天平 德国赛多利斯仪器系统有限公司；DMT-2500 涡旋振荡仪 杭州米欧仪器有限公司；HGC-24A 氮气吹干仪 天津恒奥科技发展有限公司；KQ-500 超声波清洗仪 昆山市超声仪器有限公司；优普超纯水制造系统 四川优普超纯科技有限公司；GM200 刀式捣磨仪 德国RETSCH 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准品溶液的配制 准确移取18 种磺胺标准储备液（100 μg/mL）各1 mL，用10%甲醇水溶液定容至10 mL，配制成浓度为10 μg/mL 的标准中间液。移取各标准中间液1 mL，用10%甲醇水溶液配制成浓度为1 μg/mL 的混合标准中间溶液。此外，配制1 μg/mL 磺胺间二甲氧嘧啶-D6 和磺胺邻二甲氧嘧啶-D3 内标工作液。用10%甲醇水溶液逐级稀释配制成质量浓度为5、10、20、50、100、200 ng/mL的标准工作液，同时，在每个浓度点添加50 μL 内标工作液，内标浓度为10 ng/mL。

1.2.2 样品前处理 取鲈鱼去鳞去鳃后，清洗干净取鲈鱼可食用肌肉部位，用刀式捣磨仪充分混匀粉碎。精密称取鱼肉样品5 g 于50 mL 离心管中，加入50 μL内标工作液，加入10 mL 乙腈溶液（含1%甲酸），再涡旋2 min，加入1 g 氯化钠和4 g 无水硫酸钠，涡旋5 min，振荡30 min，超声15 min，8500 r/min 离心5 min，取上清液于另一50 mL 离心管。

取2 mL 上清液过增强型脂质去除净化柱，重力自流，收集流出液，在45℃水浴下氮吹至近干，用10%甲醇水溶液定容至1 mL，过0.22 μm 微孔滤膜,待测。

1.2.3 色谱条件 色谱柱：CNW Athena C18-WP（2.1 mm×100 mm，3 μm）；流动相A 为0.1%甲酸水溶液，B 为甲醇；流速为0.3 mL/min；进样体积为10 μL；柱温30 ℃；洗脱梯度：0～0.5 min，90% A；0.5～2.0 min，90%～60% A；2.0～11.0 min，60%～10% A；11.0～11.1 min，10%～90% A；11.1～15.0 min，90% A。

1.2.4 质谱条件 电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI）；多反应监测模式（multiple reaction monitoring，MRM）；正离子模式；离子源温度（TEM）：500 ℃；气帘气（CUR）10 psi；喷雾电压（IS）5000 V；雾化气40 psi；辅助气50 psi。其他参数见表1。

表1 18 种磺胺类药物和内标的质谱参数Table 1 Mass spectrum parameters of 18 sulfonamides and internal standard

1.2.5 线性范围、检出限与定量限测定 配制质量浓度为5、10、20、50、100、200 ng/mL 的标准工作液，分别以进样浓度X（ng/mL）和峰面积Y 为横坐标和纵坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程和相关系数。以信噪比为3（S/N=3）作为检出限（limits of detection，LOD），以信噪比为10（S/N=10）作为定量限（limits of quantification，LOQ）。

1.2.6 回收率与精密度实验 在阴性鱼肉样品中各添加质量浓度为5、10、50 μg/kg 三水平的混合标准溶液，重复测定6次，计算各磺胺类药物回收率和精密度。

1.3 数据处理

采用统计软件Excel 2016、GraphPad Prism 6和Analyst 1.6.2 软件对采集和检测结果进行数据处理分析。

2 结果与分析

2.1 仪器条件的优化

2.1.1 色谱条件的优化 根据中华人民共和国国家标准GB/T 21316-2007[20]、农业农村部1025 号公告-23-2008 及文献报道，磺胺类化合物常用的流动相为乙腈[21-22]和甲醇[23-25]。此外，磺胺类化合物在酸性条件下具有较高的较稳定性和溶解性[19]，因此，本研究考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液和乙腈-0.1%甲酸水溶液对18 种磺胺类化合物的分离度、峰形及灵敏度的影响。结果表明，以甲醇-水和乙腈-水为流动相时，化合物峰形差，对于待测组分中存在的同分异构体，基线无法实现完全分离。通过比较甲醇-0.1%甲酸水溶液和乙腈-0.1%甲酸水溶液发现，在水相中加入0.1%甲酸时，待测组分峰型尖锐，拖尾现象有所改善，同时甲酸有利于提高待测物在正离子扫描模式中的离子化效率，进一步提高了灵敏度。与乙腈相比，采用甲醇-0.1%甲酸水溶液梯度洗脱时，待测物可以实现良好的基线分离。

研究发现加入甲酸铵或乙酸铵可以稳定水相，改善峰型，对同分异构体实现更好的分离效果[13,26]，然而本研究通过比较甲醇-0.1%甲酸水溶液和甲醇-0.1%甲酸-5 mmol/L 甲酸铵水溶液对待测物峰型及分离度的影响，发现加入甲酸铵对待测物峰型及分离度影响较小，因甲酸铵属于盐类化合物，考虑到试剂的消耗以及盐类流动相残留对色谱柱和仪器使用寿命的影响，因此本研究最终选择甲醇-0.1%甲酸水溶液为流动相。18 种磺胺类化合物的总离子流图如图1。

图1 混合标准品溶液总离子流图Fig.1 TIC chromatograms of mixed standard solution

2.1.2 质谱条件的优化 通过在离子源正负离子模式下对18 种磺胺类药物扫描，发现18 种磺胺类药物在正离子模式下响应较好，因此选择离子源正离子模式对磺胺类药物母离子全扫，确定目标化合物的母离子。再进一步通过二级质谱优化磺胺类抗菌药物的子离子、碰撞能以及去簇电压等参数（见表1）。采用优化后的色谱和质谱参数对18 种磺胺类药物采集，如图1所示，结果表明化合物具有良好的分离度和灵敏度，优化的仪器参数可满足磺胺类抗菌药物分析。

2.2 前处理条件的优化

2.2.1 提取条件的优化 动物源性食品中磺胺类化合物常用的提取溶剂为乙酸乙酯、甲醇[27]和乙腈[28-31]，本研究考察了上述3 种溶剂的提取效果，结果表明，甲醇提取液含有白色浑浊物，且难以通过增强型脂质去除固相萃取净化柱。乙酸乙酯和乙腈提取液较澄清透明，且易通过增强型脂质去除固相萃取净化柱。与乙酸乙酯相比，采用乙腈作为提取溶剂时，回收率相对较高。此外，磺胺类化合物结构中因含有芳伯氨基而呈现弱碱性，研究发现，使用酸化有机试剂提取，磺胺类化合物溶解度更高，提取效率较好[18,31]，与甲醇相比，乙腈极性与待测物极性相近，因动物源性食品中含有大量的脂肪和蛋白质，考虑到乙腈具有较好的蛋白沉淀效果，因此本研究在参考赵巧灵等、容裕棠等方法[8,14]基础上，最终选用1%甲酸乙腈为提取溶剂。

2.2.2 净化方式的优化 样品中大量的脂肪和蛋白质对检测结果影响较大，本研究在提取过程中加入氯化钠和无水硫酸钠，通过盐析使蛋白质沉淀，进一步减少了蛋白质对样品检测的干扰。尽管蛋白质可通过盐析后离心去除，而样品中的脂肪和磷脂等仍然会干扰待测物的检测，因此，本研究比较了新型Captiva EMR-Lipid 固相萃取柱与Poly-Sery MCX 固相萃取柱的净化效果及对磺胺类药物回收率的影响。由图2 可以看出，采用Captiva EMR-Lipid 固相萃取柱净化时，化合物回收率高，且相对稳定。此外，如图3所示，在净化过程中该净化柱无需活化、淋洗等过程，通过重力自流即可完成净化，极大地简化了样品前处理步骤，在减少有机试剂消耗的同时，有效缩短了净化时间，简便易用，省时省力，显著提高了方法的可操作性和便利性。该方法最大的优点在于采用的Captiva EMR-Lipid 固相萃取柱结合了体积排阻和疏水相互作用，在高选择性和高效去除脂质的同时，能最大程度地减少待测物的流失，从而有利于改善方法的耐用性及可靠性。

图2 不同净化柱对18 种磺胺回收率的影响Fig.2 Effects of different purification columns on recovery rates of 18 sulfonamides

图3 不同固相萃取柱对磺胺类药物净化效果的影响Fig.3 Effect of different solid phase extraction columns on the purification effect of sulfonamides

2.3 方法学考察

2.3.1 线性范围、检出限与定量限 配制质量浓度为5、10、20、50、100、200 ng/mL 的标准工作液，按照1.2 步骤测定。以信噪比为3（S/N=3）作为检出限（LOD），以信噪比为10（S/N=10）作为定量限（LOQ）。结果表明，18 种磺胺类抗菌药物在5～200 ng/mL 范围内具有良好的线性关系，相关系数r≥0.9962，方法的检出限为0.11～0.47 μg/kg，定量限为0.37～1.57 μg/kg（见表2）。

表2 18 种磺胺类抗菌药物的线性范围、相关系数、回归方程、检出限和定量限Table 2 Linear range, correlation coefficients, regression equations, limits of detection and limits of quantification of 18 sulfonamides

2.3.2 回收率与精密度 按1.2.6 项下方法，向阴性鱼肉样品中分别添加浓度为5、10、50 μg/kg 三水平的回收率试验，每个添加水平重复测定6次。结果表明，3 个添加水平下鲈鱼样品中18 种磺胺类抗菌药物的平均回收率为73.30%～116.9%，相对标准偏差为0.29%～7.74%。结果表明该方法回收率和精密度良好，可满足鲈鱼中18 种磺胺类抗菌药物残留检测的需求（见表3）。

表3 18 种磺胺类抗菌药物在鱼肉中的回收率和相对标准偏差（RSD）（n=6）Table 3 Recoveries and relative standard deviations of 18sulfonamidesin fish meat (n=6)

续表 3

2.4 实际样品的测定

采用本研究建立的检测方法测定当地市售的15 份鲈鱼样品，结果显示，18 种磺胺类药物在15 份鲈鱼样品均未检出。

3 结论

本研究采用新型的增强型脂质去除净化柱结合高效液相色谱-串联质谱法以内标法定量，建立了鲈鱼样品中18 种磺胺类药物残留的检测方法。通过对色谱、质谱条件以及提取溶剂和净化方式的优化，样品以1%甲酸乙腈提取，采用新型的增强型脂质去除固相萃取柱净化，可以有效去除脂质和蛋白质等干扰物，有效提高了回收率，达到了更好的净化效果。该方法操作简单，无需活化、淋洗和洗脱等过程，在减少有机试剂消耗的同时，省时省力，线性关系良好，回收率和精密度均可满足检测分析的需求，适用于以鲈鱼为主的多种水产品中磺胺类药物残留的检测分析。