吴雯娟 刘国华 陈俊萍 徐少华 谭磊

摘  要：本文建立了猪尿中15种磺胺类药物残留的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）分析方法。15种磺胺类药物残留在线性范围2.00 μg/L～500.00 μg/L内的r值在0.999 6以上，方法检出限均在0.333 μg/L以下，2.00 μg/L、6.00 μg/L、100.0 μg/L 3个水平的阳性添加回收率范围在94.2%～104.0%之间，相对标准偏差在1.1%～10.6%之间，具有较好的精密度和准确度，满足检测要求。方法简单、快速、准确，可适用于尿液中15种磺胺类药物残留的检测。

关键词：磺胺;残留;猪尿;超高效液相色谱-串联质谱

中图分类号：S859.84 文献标志码：A 文章编号：1001-0769（2019）08-0069-05

磺胺类药物（Sulfonamides，SAs）是指具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称，是现代医学中常用的一类抗菌药物，具有广谱、稳定、经济、易用等特点，可用于预防和治疗细菌感染性疾病，常配合抗菌增效剂以作为饲料添加剂，来预防疾病的发生和促进动物生长[1]。臨床研究表明，磺胺类药物在体内的代谢时间较长，长期使用可能在人体中蓄积，导致人体机能损害，诱使病原体产生抗药性[2]。另外，磺胺类药物半衰期较短，但由于频繁地被使用并进入环境，形成环境中抗生素的“假持续”现象，对人体安全及整个生态系统构成了长期的潜在风险[3]。《中华人民共和国农业部公告》第235号公告（2002）规定了磺胺类总量在所有动物的肌肉、脂肪、肝、肾和奶中最高残留限量为100 μg/kg，磺胺二甲嘧啶在牛奶中的最高残留限量为25 μg/kg[4]。2017年，农业部印发了《全国遏制动物源细菌耐药行动计划          （2017—2020年）》，针对促生长用抗菌药物，将积极稳妥地推动实施“退出行动”。可见抗菌类药物滥用的问题已引起社会各界的高度关注。

目前，我国对磺胺类药物残留的检测方法主要有酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）、胶体金法、液相色谱法和液相色谱-质谱法以及超高效液相色谱串联飞行时间质谱法等[5-10]，基质主要为农产品可食用部分，缺少尿液中的检测方法，导致在抽取农产品样品检测时，多半已处于流通待售环节，具有滞后性，影响市民的肉食安全。本文采用超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS），建立了猪尿中15种磺胺类药物残留简便、快速、高效的检测方法，可以为生猪屠宰入市之前提供猪尿中磺胺类药物残留检测依据，防止被磺胺类药物污染的生猪流入市面，对维护人民健康具有重要意义。

1  材料与方法

1.1 试验材料

取猪尿液，离心取上清，4 ℃保存。

1.2 仪器与设备

AB Sciex Triple QuadTM 4500质谱仪、N-EVAP-24型全自动氮吹仪、多管漩涡混合仪（杭州奥盛仪器有限公司）、梅特勒PL602E型天平、Sigma 3K15冷冻离心机和Milli-Q Integral 3型超纯水仪。

1.3 主要试剂与标准物质

乙腈、甲醇、甲酸均为色谱纯。

复溶液：甲醇/水/甲酸（10∶90∶0.09，v/v/v）。

磺胺间甲氧嘧啶（Sulfamonomethoxine，SMM）、磺胺二甲氧嘧啶（Sulfadimethoxine，SM2）、磺胺喹噁啉（Sulfaquinoxaline，SQX）、磺胺嘧啶（Sulfadiazine，SD）

标准物质：磺胺类药物[磺胺二甲氧嘧啶（Sulfadimethoxine，SM2）、磺胺甲氧哒嗪（Sulfamethoxypyridazine，SMP）、磺胺间甲氧嘧啶（Sulfamonomethoxine，SMM）、磺胺氯哒嗪（Sulfachloropyridazine，SCP）、磺胺吡啶（Sulfapyridine，SMPD）、磺胺苯吡唑（Sulfaphenazole，SPP）、磺胺甲恶唑（Sulfamethoxazole，SMZ）、磺胺地索辛（Sulfadimethoxine，SDM）、磺胺醋酰（Sulfacetamide，SA）、磺胺二甲异恶唑（Sulfisoxazole，SIZ）、磺胺噻唑（Sulfathiazole，ST）、磺胺邻二甲氧嘧啶（Sulfadimoxine，SDM）、磺胺对甲氧嘧啶（Sulfametoxydiazine，SMD）、磺胺笨酰（Sulfabenzamide，SB）、磺胺二甲唑（Sulfamoxol）]均为德国Dr. Ehrenstorfer。

1.4 标准溶液的配置

标准储备溶液：准确称取15种标准物质，用甲醇分别配成约1.00 mg/mL的标准储备液， 放入-18 ℃冰箱中保存。

1.5 试验方法

量取1.00 mL试样置于50 mL离心管中，加入20 mL乙腈和5.0 g无水硫酸钠，充分涡旋震荡10 min，9 000 r/min离心5 min。移取5.00 mL上清液置于15 mL离心管中，50 ℃水浴氮吹近干。加入1.00 mL复溶液，过0.22 μm滤膜，供液相色谱—串联质谱测定。

1.6 仪器条件

1.6.1 高效液相色谱条件

色谱柱：ACQUITYUPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）;流动相A相为0.1%甲酸水溶液;流动相B相为甲醇;柱温为40 ℃;进样量5.0 μL。梯度洗脱程序见表 1。

1.6.2 质谱条件

离子源为电喷雾离子源，扫描方式为正离子扫描，检测方式是多反应监测，电喷雾电压为5 500 V，离子源温度为 600 ℃，气帘气压力采用30 psi，碰撞气压力为8 psi，雾化气压力为60 psi，辅助加热气压力为65 psi。

定性离子对、定量离子对、采集时间、去簇电压及碰撞能量见表2，空白基质及添加药物样本色谱图见图1。

2  结果与讨论

2.1 标准曲线

精密量取磺胺类药物（SM2、SMP、SMM、SCP、SMPD、SPP、SMZ、SDM、SA、SIZ、ST、SDM、SMD、SB、Sulfamoxol）混合标准溶液，添加到6份1.00 mL空白尿液中，制得浓度分别为2.00 μg/L、5.00 μg/L、10.0 μg/L、50.0 μg/L、100 μg/L和500 μg/L的各系列空白添加试样，按1.5試验方法处理试样，供液相色谱串联质谱测定，以峰面积为纵坐标，各化合物的浓度为横坐标建立标准曲线，线性范围、回归方程和相关系数见表3。15种磺胺类药物基质试验的线性范围在2.00 μg/L～  600 μg/L内，峰面积与相应回收浓度呈现良好的线性关系，相关系数（r）均在0.999 6以上。

2.2 方法检出限确定

取空白猪尿样品，添加浓度为2.00 μg/L，按照1.5试验方法进行处理和测定，平行样本数n=7，根据各样本检测值计算出平均值（x）及标准偏差（Sb），再根据公式检出限（MDL）=（k×Sb×C）/x（其中：k为置信因子，一般取3），计算出SM2、SMP、SMM、SCP、SMPD、SPP、SMZ、SDM、SA、SIZ、ST、SDM、SMD、SB和磺胺二甲基恶唑（sulfamoxol）的检出限分别为0.200 μg/L、0.175 μg/L、0.210 μg/L、   0.159 μg/L、0.183 μg/L、0.333 μg/L、0.286 μg/L、0.220 μg/L、0.090 μg/L、0.329 μg/L、0.172 μg/L、0.145 μg/L、       0.171 μg/L、0.146 μg/L和0.106 μg/L。15种磺胺类药物的检出限均在0.333 μg/L  以下。

2.3 回收率测定

以空白尿样为基质，进行2.00 μg/L、  6.00 μg/L、100 μg/L 3个水平的阳性添加回收试验，每个水平取6个平行样，按1.5试验方法进行处理和测定。15种磺胺类药物的平均回收率和相对标准偏差结果见表4。15种磺胺类药物在2.00 μg/L、6.00 μg/L、100 μg/L 3个  水平的阳性添加回收率范围在94.2%～104.0%之间，相对标准偏差在1.1%～10.6%之间。

3  结论

方法建立了猪尿中15种磺胺类药物残留的超高效液相色谱-串联质谱测定方法。样本经过提取、净化，有效地消除了基质干扰，方法具有较高的灵敏度，且操作简单便捷。经过优化试验验证，该方法简单、快捷和易操作，可大大缩短检测时间，节约人力物力，能有效消除基质干扰，具有较好的精密度和准确度，满足检测要求，适用于尿液中15种磺胺类药物残留的检测。方法将检测基质从“肌肉”改为“尿液”，实现监控点前移，在养殖过程中和屠宰前即可实施磺胺类药物检测，保障出栏食品动物质量，确保残留超标的畜产品不会进入市民餐桌，对从源头上切实保障市民的肉食安全，具有重要意义。□□

参考文献：（10篇，略）