张明春，梁丽文，张梦阳，赵永威，刘蒲临，缪礼鸿，王 霜

（1.湖北白云边酒业股份有限公司，湖北松滋 434200；2.武汉轻工大学生命科学与技术学院，湖北武汉 430023)

中国传统白酒发酵是一种自然发酵的过程。前期通过制曲，曲块自然老熟网罗周围环境中的微生物，进行第一次富集；酒醅进行堆积和入池，进行第二次富集。所形成的微生物群落比较复杂，包括细菌、霉菌、酵母菌等。在酱香型白酒堆积和入池发酵过程中，酵母是重要的微生物类群，对挥发性化合物的产生做出了重大贡献，这些化合物决定着最终产品的整体质量和风味。

随着对酿造过程中酵母菌的深层研究，较多的科研院所和酒厂将功能酵母添加到白酒发酵中，以期提高出酒率和丰富酒质。余伟民等将酒用干酵母应用于特香型白酒发酵，在不改变特香型白酒风味的基础上，白酒产量得到显著提高，出酒率最高可达65%，总酸、总酯含量略微下降；董永胜等在白酒酒醅中筛选得到1 株可以在38 ℃和pH3.0 的基质中表现出优良发酵性能的酒精酵母，将之添加到固态白酒的生产中，酒精产量提高了30%；纪志军等将耐高温活性干酵母用于浓香型大曲酒生产，可提高淀粉出酒率1%～3%。在白酒酿造中，非酿酒酵母也有较多应用，包括毕赤酵母、东方伊萨酵母、假丝酵母等。这类酵母与酿酒酵母混合发酵能显著改变酒体品质，抑制发酵过程中一些腐败微生物的繁殖。胡建华等从牛栏山酒酒醅中筛选出了l株高产乙酸乙酯的酵母菌株并将其应用于生产，结果显示，实验组乙酸乙酯的含量比对照组提高109%，且香气正、带酯香、味柔、尾味净。将酿酒酵母和非酿酒酵母混合应用到白酒发酵中，不仅可以提高产物风味复杂性，还可以加强独特性。唐洁等研究了酿酒酵母和异常毕赤酵母混菌发酵对白酒液态风味物质的影响，结果显示，这2 种菌混和发酵可以形成更多的酯类物质，同时显著提高其风味特性；许玲从芝麻香酒醅中分离筛选得到8 株生香酵母菌株，选取4 株优良菌株添加到白酒发酵中，乙酸乙酯含量提高了1.99 倍，己酸乙酯提高了1.09倍，戊酸乙酯提高了1.24倍；任道群等从浓香型大曲中筛选出4 株优良微生物：糖化菌A2-3 和LZ-24、酯化菌R-3、发酵菌S2，将4 株菌株组合强化到大曲中运用到酿造过程中，可使出酒率提高10.9%，己酸乙酯增加15.7%。

在白酒酿造中，将酵母菌、霉菌和细菌等进行混合发酵，同只添加酵母菌剂相比，多菌混合能显著丰富酒体，或可以代谢提高某类有益风味物质的含量，或可以分解一些异味物质，或可以促进酵母的生产代谢，最终改变发酵产物的风味特征。赵素芬等初步探索了混合菌剂在酱香型白酒的应用，结果表明，以嗜热芽孢杆菌和酵母菌制成的麸曲，具有降低粮耗、缩短发酵时间等优点；胡建华等从清香大曲及酒醅中筛选出13株酿酒微生物，包括根霉、酿酒酵母、芽孢杆菌，将其单独制作成麸曲，以一定比例代替大曲添加到酒醅中，所得基酒的总酸、总酯含量显著增高，出酒率也得到一定提高；艾金忠等在二锅头原酒生产中同时使用高酯化酶活性红曲霉和生香酵母，延长发酵周期，结果表明，总酯的含量平均提高了0.409 g/L，乙酸乙酯的含量平均提高了0.309 g/L，同时原酒的风格典型性得到了提高；张东平等从清香大曲和酒醅中分离筛选到高糖化酶活力根霉2 株，高发酵力酵母1株，将其制成麸曲，添加到牛栏山酒酿造中，出酒率从17 %提高到25.3 %，同时还起到了“增乙降乳”的效果。

本研究对分离自白云边不同轮次酒醅中的7株酵母菌进行发酵性能比较，筛选出1 株具良好发酵能力的酵母菌Scc7，并对纯种及混合发酵效果进行分析，优化得到发酵效果好的方案。将Scc7 制成固态复合功能菌剂替代一定比例的大曲，一方面能减少大曲用量降低企业生产成本，另一方面可提高发酵产酒率和酒质，具有良好的应用前景。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

本研究所使用菌株及来源如表1所示。

表1 本研究所使用酵母菌株

1.2 培养基

YPD 液体培养基：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，酵母粉10 g，水1000 mL，115 ℃灭菌20 min。

同化碳源基础固体培养基：碳源2 %，七水硫酸镁0.05%，酵母粉0.02%，硫酸二胺0.5%，琼脂1.5%～2%，水1000 mL，115 ℃灭菌20 min。

高粱糖化液培养基：粉碎50 g高粱，加入180 mL蒸馏水使淀粉含量在18 %左右，65 ℃水浴糊化30 min，92 ℃水浴，按15 U/g 淀粉加入液化酶液化90 min，冷却后调pH 4.0～4.5,然后65 ℃水浴，按150 U/g 淀粉加入糖化酶糖化30 min，冷却后待接种。

1.3 实验方法

1.3.1 酵母菌耐高温能力的测定

将酵母菌在YPD 琼脂平板上划线接种，分别置于37 ℃、39 ℃、42 ℃、45 ℃和47 ℃培养箱培养24～48 h，取出平板观察生长状况并记录。

1.3.2 酵母菌碳源利用实验

本研究选取单糖：葡萄糖；双糖：蔗糖；三糖：D-棉子糖；五碳糖：D-木糖；六碳糖：D-半乳糖；醇类：甘油。在同化碳源基础培养基中以这6 种不同的糖为唯一的碳源，接种各酵母菌，于35 ℃培养箱培养48 h，观察生长情况并记录。

1.3.3 高粱糖化液制备与发酵

YPD 平板活化酵母菌，于35 ℃恒温培养箱中培养2 d，单菌落长出后，接种于YPD 液体培养基，170 r/min 摇床18 h，按2 %接种量接种于高粱糖化液培养基中，28 ℃静置发酵3 d后，蒸馏发酵液。蒸馏方法：将发酵液（约220 mL）蒸出30 mL，过滤后进气相色谱分析。Scc7 与标准菌株1056 高粱糖化液酒精发酵比较时，则是将发酵液（约220 mL）蒸出100 mL，过滤进气相色谱分析。

1.3.4 酵母功能菌剂的制备

YPD 平板活化酵母菌，于35 ℃恒温培养箱中培养2 d，单菌落长出后，接种于YPD 液体培养基中，于摇床170 r/min、35 ℃培养18 h，按20 %的接种量接入已灭菌的麸皮基质中，在35 ℃恒温培养箱中发酵30 h，中间搅拌1 次。烘干至水分降低至13%左右。计活菌数，装袋低温保存备用。

1.3.5 霉菌菌剂制备

将分离自白云边酒高温大曲中的根霉菌用YPD 琼脂平板活化，30 ℃恒温培养箱培养2 d，菌落长出后，接种于YPD 液体培养基中（种子瓶），于摇床170 r/min、30 ℃培养18 h，按4 mL 的接种量接入每1 L 三角瓶中装有150 g 已灭菌的麸皮中，在30 ℃恒温培养箱中发酵72 h，每24 h 搅拌1 次。于无菌烘箱中烘至水分降低到13 %左右，装袋低温保存备用。

1.3.6 固态发酵条件

使用温度大于90 ℃的水浇淋焖粮3 次，每次30 min。蒸粮90～120 min，使含水量保持在55 %左右。将曲粉或曲粉与菌剂混合物以10%的比例添加到冷却至室温的高粱中混合均匀。将混合均匀的原料置于大塑料袋中模拟堆积发酵过程。控制堆积温度，使其前24 h 维持在37 ℃，然后升温至42 ℃保持12 h，最后升温至50 ℃维持12 h。模拟堆积发酵结束后，将堆积原料分装于玻璃瓶中，28 ℃恒温进行厌氧酒精发酵。

2 结果与分析

2.1 不同酵母菌株的温度耐受性

本实验所采用酵母菌株在37 ℃下均生长较好（表2）。在39 ℃下，除有孢圆酵母Toc7 和假丝酵母Cac6外，其他6 株酵母生长较好。固态白酒发酵的堆积过程中，堆积料中心的温度往往可以达到50～60 ℃，这就需要制备菌剂的酵母具有一定的耐高温能力。在42 ℃高温下，Pic3、Pic5、Isc5、Sac5和Scc7 这5 株酵母均可以生长，适合物料堆积的高温发酵阶段。

表2 不同酵母菌的温度耐受性

2.2 不同酵母菌碳源同化能力

从表3 可知，所有酵母菌均对葡萄糖展现出了较好的同化利用能力。Pic3 和Isc5 碳源谱较广，生长旺盛，其次为Sac5、zyr5 和Toc7。Scc7 不能利用木糖、半乳糖和甘油；除葡萄糖外，Cac6 仅在以蔗糖为唯一碳源的培养基上有明显生长。

表3 酵母菌对不同碳源的同化利用能力

2.3 不同酵母菌高粱糖化液发酵实验

气相色谱研究表明（表4），8 株酵母菌高梁糖化液产酒精能力差异较大，发酵液中酒精度大小为Scc7＞Sac5＞Pic3＞Isc5＞To7＞Cac6＞Zyr5。其中，Scc7 的酒精度为16.9%vol，仅比安琪酿酒酵母的低0.5%vol。产正丙醇方面，除Pic5 不产正丙醇外，剩余菌株产正丙醇能力依次为Zyr5＞Sac5＞Isc5＞Toc7＞Pic3＞Cac6＞Scc7。8 株酵母中，仅有Toc7、Isc5 产乳酸乙酯，其他6 株均不产生乳酸乙酯。结合8 株酵母的耐高温能力，综合比较，Scc7、Sac5、Pic3、Isc5 和Toc7 这5 株酵母各有优点，因此制成纯种菌剂后进一步比较对白酒风味的影响。

表4 不同酵母菌在高粱糖化液中的发酵研究

2.4 5种酵母菌株的固态发酵实验

在最佳培养温度下培养Scc7、Sac5、Pic3、Isc5和Toc7，制备得到菌剂后添加到蒸煮后高粱中，实验室模拟固态白酒发酵。气相结果见表5。

表5 5种酵母菌剂的纯种固态发酵气相结果

5 种酵母菌株固态发酵后其酒精度大小为Scc7＞Toc7＞Sac5＞Pic3＞Isc5；正丙醇含量依次为Sac5＞Toc7＞Pic3＞Scc7＞Isc5；乙酸乙酯的含量大小为Sac5＞Scc7＞Pic3。这5 株酵母添加到发酵过程中均不产生乳酸乙酯。其中，Scc7菌剂添加后，酒精度最高，乙酸乙酯含量也较高，同时，正丙醇含量低；Pic3 菌剂添加后，酒精度比添加Scc7 菌剂低0.8%vol，乙酸乙酯含量相当。Scc7 菌剂在提高出酒率和改善酒质方面都有较好效果。

2.5 Scc7发酵性能与1056、TRADY的比较研究

粟酒裂殖酵母Scc7、粟酒裂殖酵母标准菌株cicc1056 和安琪酿酒酵母TRADY 分别进行液态纯种发酵，发酵结束后对发酵结果进行气相色谱分析。从表6 可以看出，Scc7 发酵乙醇产量与TRADY 差别不大，与粟酒裂殖酵母标准菌株cicc1056 相比提高了16.25 %±1.36 %；Scc7 发酵正丙醇产量较安琪酿酒酵母低43.64%±3.36%，异戊醇产量较安琪酿酒酵母明显下降，醋酉翁（3-羟基丁酮）产量明显较cicc1056 和安琪酿酒酵母高。上述结果表明，Scc7 菌株具有较高的产酒精能力，与安琪酿酒酵母相当，发酵产高级醇总量（正丙醇、异丁醇、异戊醇等）较安琪酿酒酵母有所下降，且Scc7具有一定的产风味物质-醋酉翁（3-羟基丁酮）的能力，通过比较可以发现Scc7 是一株具有高产乙醇、低产高级醇和提高白酒中风味成分含量能力的优质酵母菌株。

表6 Scc7、cicc1056和TRADY发酵性能对比 (mg/L)

2.6 大曲和Scc7功能菌剂混合固态白酒发酵

以大曲用量30%的比例加入Scc7 菌剂同1 个月大曲混合发酵与4 个月大曲发酵结果进行比较。结果表明，添加大曲及大曲、菌剂混合发酵，酒精度大小依次为1 个月＋Scc7＞4 个月＞1 个月（图1a）。其中，1 个月＋Scc7 菌剂的酒精度较4 个月提高了20.8%，较1 个月提高了55.5%。正丙醇含量大小依次为4 个月＞1 个月＞1 个月＋Scc7（图1b）。其中，1 个月＋Scc7 菌剂的正丙醇含量较4 个月降低了57.78%，较1 个月降低了48.49%。乙酸乙酯含量大小依次为4 个月＞1 个月＋Scc7＞1 个月（图1c）。其中，添加Scc7 菌剂后乙酸乙酯的含量较1个月高，但远远低于4个月样本。

图1 大曲和Scc7功能菌剂混合固态发酵后关键参数的比较

以大曲用量的20%加入Scc7 菌剂、5%的霉菌菌剂同一个月大曲混合发酵比较。添加大曲及大曲、菌剂混合堆积发酵，酒精度大小依次为1 个月＋根霉＋Scc7＞4 个月＞1 个月（图2a）。其中，1个月＋根霉＋Scc7 菌剂的酒精度较4 个月提高了1.7%，较1 个月提高了32.02%。添加1 个月大曲、酵母菌剂和霉菌菌剂的酒醅其正丙醇含量最高（图2b），较4 个月提高了29.2 %，较1 个月提高了82.6%。添加1个月大曲＋Scc7菌剂＋霉菌菌剂的酒醅其乙酸乙酯含量最高（图2c），较4 个月提高了25.8%。

图2 大曲、Scc7和根霉功能菌剂混合固态发酵后关键参数的比较

3 总结

对酒醅中分离得到的7 株不同种的优势菌株进行比较，毕赤酵母Pic3、东方伊萨酵母Isc5、酿酒酵母Sac5 和粟酒裂殖酵母Scc7 可以耐受42 ℃的高温，以高粱糖化液为发酵培养基，Scc7 的产乙醇能力最强，同市售的安琪酿酒酵母相当，同时产正丙醇最低。同标准菌株1056 相比，Scc7 耐乙醇能力更强，在以高粱糖化液为发酵培养基时酒精度提高了8.7%，乙酸乙酯含量提高了22.2%，正丙醇含量降低了9.9%，同时产3-羟基丁酮。将Scc7 菌剂按总添加量30 %的比例同1 个月大曲混合添加到模拟白酒发酵过程中，酒精度较只添加1 个月大曲提高了55.5 %，较只添加4 个月大曲提高了20.8 %；正丙醇含量较只添加1 个月大曲降低了48.49 %，较只添加4 个月的大曲降低了57.78 %。实验结果表明，以该菌株制备的功能菌剂显示了在白酒酿造中具有潜在的应用价值。