朱伟，沈爱国*，胡继明

(1.武汉大学印刷与包装系，武汉 430079;2.武汉大学化学与分子科学学院，武汉 430072)

1 引言

光学显微镜的革新，极大地扩展了我们在微观层面的认知，也激发了研究者们对生物奥秘的不断探索[1-2]。近年来，共聚焦拉曼显微成像技术在分子生物学分析、疾病诊断和药物发现等方面取得了很大进展[3-6]。然而生物分子的拉曼散射收集信号的灵敏度低，拉曼谱图的对目标物的选择性差，并且生物的拉曼图谱解析复杂。因此，基于拉曼的光学标签作为生物医学中的示踪剂得到了广泛的研究，尤其是三键(炔基、氰基等)标记技术具备无生物内源性干扰的优势而得到了研究者们的重视。三键的拉曼标签“点亮”了细胞中葡糖糖、DNA、蛋白质等生物分子和多个细胞器的“踪迹”，又实现了生物目标物的精确定量检测[7-8]。

值得关注的是，三键的拉曼散射峰小于2 nm，有望突破复杂生物系统中标记的“颜色极限”而被用于生物多元甚至高通量的标记研究，这也需要大量的可辩析的拉曼标签，且标签的信号输出与目标物能一一对应。然而，目前基于三键拉曼位移不同而制备的三键标签难以进一步突破“颜色极限”，其复杂的有机合成限制着不同三键信号分子用作三键标签的发展。还有一个重要的问题在于小分子的三键标签的信背比低，这难以实现有效的标记研究[9-12]。因此寻找新的光谱方法和开发特定的光学标签迫在眉睫。

基于此，我们提出了一种拉曼强度编码策略来合成具有可区分拉曼光谱信号输出的三键纳米标签。首先，通过改变含有三键的单体的分子结构，可以很容易地合成出不同的聚合物；其次，通过两种单体共聚并对所得信标的拉曼强度进行编码，设计出更多可用的标签。此外，利用丙烯酸作为另一种单体共聚形成的，聚合物可以负载大量的羧基，特定的细胞靶向分子通过氨基和羧基的反应可修饰到这些聚合物的表面，制备的三键聚合物可应用于细胞的识别和成像。

2 实验部分

2.1 原料和试剂

4-乙烯基-2-甲氧基-苯甲腈为实验室自己合成。氰基苯乙烯、丙烯氰、丙烯酸、N-(2-氨基乙基)-4-甲基-苯磺酰胺、2-氨乙基-三苯基溴化瞵，N, N-二甲基-乙二胺、叶酸都购买于sigma公司；1-乙基-(3 -二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、 N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)、偶氮二异丁腈(AIBN)、十二烷基硫酸钠购买于中国医药集团有限公司。所有试剂都是分析纯以上，实验中可直接使用，无需进一步纯化。

2.2 三键聚合物的合成

选择即含三键(氰基)又含乙烯基的小分子为聚合物的单体，采用乳液聚合的方式将分子结构不同的含三键单体聚合组装成乳胶粒。具体实验过程如下：4-乙烯-2-甲氧基-苯甲腈(0～50 mg)、氰基苯乙烯(0～50 mg)、丙烯氰(0～50 mg)和丙烯酸(10 mg)加入50 mL的三口圆底烧瓶后加入10 mL水，室温搅拌(800 r/min)；随后于混合液中加入1 mL的十二烷基硫酸钠(2 mg/mL)于混合液中，室温搅拌30分钟(800 r/min)；同时通入高纯N2排除体系中多余的气体，油浴加热至70℃时，加入0.6 mL AIBN溶液(10 mg/mL, DMSO)引发反应，反应2 h后，所得淡蓝色乳液即为三键聚合物标签。反应后，待乳液自然冷却到室温，采用透析除杂的方式对合成的聚合物乳液进行纯化处理，乳液装入透析袋中(3500 Da)，每隔6 h换水，透析一周后保存在4℃冰箱备用。

2.3 用于活细胞中细胞器多色成像的拉曼标签的合成

用于细胞器成像的拉曼标签合成步骤如下：分别取2 mL上述四种不同的乳液于10 mL玻璃瓶中，放入磁子搅拌(600 r/min)，陆续加入20 mL的EDC(5 mg/mL)和20 mL的NHS(4 mg/mL)溶液，室温下缓慢搅拌30 min；选择靶向细胞器且带有氨基的分子加入上述混合液中，具体对应的分子修饰如图3-1所示，N-(2-氨基乙基)-4-甲基-苯磺酰胺(5 mg)加入上述P1乳液中，(2-氨乙基)三苯基溴化瞵(2 mg)加入上述P2乳液中，N, N-二甲基乙二胺(5 mg)加入P3乳液中，叶酸(2 mg)加入P8乳液中；室温搅拌12 h之后，将所形成的拉曼标签放入透析袋(截留3500 Da分子)中透析除杂，每隔6 h换水，透析3天；最终产物于4℃保存，供后续使用和表征。标签命名如下：ER-P1，Mito-P2，Lyso-P3，CM-P8，分别对应于内质网，线粒体，溶酶体以及细胞膜。

2.4 拉曼标签的表征

利用激光共聚焦拉曼光谱(inVia Renishaw, UK)对所有样品的拉曼图谱进行表征。液体样品放入0.5 mm毛细管，在拉曼光谱仪完成对焦后，拉曼采集条件为：532 nm激光，40 mW激光强度，10 s的曝光时间，2次累计。场发射的扫描电镜(FESEM, Zeiss SIGMA, UK)对标签的形貌进行表征。将所有样品水溶液置于硅片上，待自然干燥后进行喷金处理，以提高FESEM的导电性，10kv电压下完成图像的采集。

3 分析与讨论

3.1 拉曼标签的制备及表征

采用传统的乳液聚合法合成一系列的三键聚合物。如图1所示，三键的小分子单体通过共价键连接聚集形成大分子的聚合物；并且调整两种三键单体的比例且在同一体系中共聚，所制备出的聚合物使得两种三键的拉曼强度可以进行调节，即通过强度编码的形式制备出更多的具有三键拉曼信号的拉曼活性聚合物。在聚合物纳米粒子上引入有靶向功能的分子即可制备出三键的纳米拉曼标签用于目标物的标记识别。

图1 含三键聚合物的纳米标签的合成示意图Fig.1 Schematic of polymer nanotags containing with triple bond

合成的三键聚合物的拉曼光谱如图2a所示，三种分子结构不同的三键单体聚合得到的拉曼活性聚合物(P1，P2，P3)在1800～2800 cm-1拉曼光谱区域内分别有一个尖锐的拉曼散射峰，对应于2223 cm-1、2227 cm-1和2241 cm-1。由于聚合物含有大量的三键且聚合物中无强的共轭分子结构，因此标签的光谱具有高信噪比(>5)中且未观察到其他背景的拉曼信号。聚合物P1、P2和P3的拉曼位移显著不同，这归因于聚合物分子结构的供电子和吸电子效应。虽然通过改变含三键的单体的分子结构可以通过独特的三键振动获得更多新颖的拉曼活性聚合物，但这种策略必须提前准备好分子结构不同的单体，这需要很多的有机合成路线来完成，并且相应的成本也会很大。为了打破这一瓶颈，我们提出了另一种方法，通过调节三键拉曼信号的比值来编码三键的强度，可以获得独特的拉曼光谱，从而合成更多的拉曼活性聚合物作为拉曼标签。图2b、c为所制备的三键聚合物的自发拉曼光谱图，共聚合的方式并调整4-乙烯基-2-甲氧基-苯腈和4-乙烯基-苯腈两种单体的比例，所制备的拉曼标签在1800～2800 cm-1光谱范围内有两个峰，且每一个标签的两个峰的比率可以进行调节。综上，可以得到15种具有独特拉曼光谱的标签(P1-P15)。为了对所制备聚合物的拉曼强度进行表征，将P1-P3聚合物与5‐乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷(EdU)的拉曼强度进行对比。如图2d所示，P1、P2、P3浓度比EdU低100倍，但P1、P2、P3的拉曼强度比EdU都要高，表明所制备的拉曼活性聚合物的拉曼强度较好，可用于生物标记使用。

图2 (a)P1-P3聚合物的拉曼图谱；(b)P4-P10聚合物的拉曼图谱；(c)P10-P15聚合物的拉曼图谱；(d)P1-P3与EdU的拉曼强度对比图Fig.2 (a) Raman spectra of P1-P3 polymers; (b) Raman spectra of P4-P10 polymers; (c) Raman spectra of P10-P15 polymers; (d) Raman intensity of P1-P3 versus EdU

3.2 细胞器靶向的拉曼标签的制备及表征

每个细胞器对于机体的正常功能和生命活动都承担着重要的角色。比如，溶酶体(Lyso)是低pH(约4.50)的细胞单层消化腔室，主要负责将生物大分子降解为低分子量物质，而且也参与了许多关键的生命活动，包括细胞内的转运，凋亡，胆固醇稳态等；内质网(ER)负责生产三维功能蛋白质，并且调控基础蛋白质、脂类和碳水化合物的稳态以及合成；线粒体(Mito)是能量的供体，它主要是调节能量产生，钙循环等。除细胞器之外，细胞膜也是细胞中重要的组成部分，它是细胞维持稳定代谢以及调节和选择物质进出细胞的最重要的通道，且膜上蛋白可以反映细胞的生理状态。因此，针对细胞中特定细胞器和细胞膜靶向成像已经引起了研究者们广泛的关注，细胞成像不仅可以跟踪它们的形态变化，可以帮助理解它们的生物作用，也可以为寻找潜在的疾病治疗位点提供依据[13]。三键聚合物由于其独特的三键振动的多光谱能力，可以用于标记细胞中多重物质的可视化研究，本文选用四种聚合物拉曼标签，对三种亚细胞器以及细胞膜的成像进行研究。通过聚合物上的COOH基团引入不同的靶向基团，叔胺具有强质子可以靶向酸性溶酶体腔内，将其修饰于P1上用于靶向溶酶体(Lyso-P1)；三苯基膦(TPP+)是一种带正电荷的与线粒体基质具有高亲和力的基序，将其修饰在到P2上用于靶向线粒体(Mito-P2)；苯磺酰胺修饰于P3用于靶向内质网(ER-P3)；由于肿瘤细胞膜富含叶酸受体蛋白，所以采用叶酸附着在P8上用于靶向于肿瘤细胞膜(CM-P8)。如图3所示，合成的聚合物(P1, P2, P3, P8)呈现十分均一的球形，粒径大约为80 nm，这与水合粒径表征结果相吻合。由拉曼标签Lyso-P1、Mito-P2、ER-P3、CM-P8的FESEM图像可知，拉曼标签(图3 E-H)也是十分均一的球形，实际观察到的粒径与P1、P2、P3、P8结果相似，这些纳米级的标签更容易进入细胞。FESEM图像难以观察到小分子的存在，但从图像中能够发现拉曼标签的聚合物球相比空白的标签，变得不光滑，推测有其他物质负载在聚合物表面。

图3 (a-d)拉曼活性聚合物的FESEM图像;(E-H)细胞器靶向拉曼标签的FESEM图像。(a)P1;(b)P2;(c)P3;(d)P8;(e)Lyso-P1;(f)Mito-P2;(g)ER-P3;(h)CM-P8Fig.3 (a-d) FESEM images of Raman active polymers; (e-h) FESEM images of specific subcellular organelle probes. (a) P1; (b) P2; (c) P3; (d) P8; (e) Lyso-P1; (f) Mito-P2; (g) ER-P3; (h) CM-P8

3.3 三键标签用于细胞器成像的研究

所制备的三键聚合物修饰上对细胞器有靶向功能的小分子，并将所制备出的三键标签用于细胞器靶向的成像研究。如图4所示，四种标签的三键拉曼散射信号各异。图4a-c分别为标签对于活细胞溶酶体、线粒体、内质网的拉曼成像图，在细胞中可以探测到标签的拉曼信号，将所检测到的三键拉曼信号转化成“颜色”来表达其分布，可以发现三键标签在细胞中有较好的分布，且三键标签可以标记出不同细胞器的位置。值得关注地，图4d代表用于细胞膜的拉曼成像图，选用的标签具备三键的双峰信号输出特点。利用三键的两种拉曼位移为拉曼“颜色”输出，其两者颜色的叠加可以再转换成另外的一种颜色，其颜色装换也就实现了标签对于目标物的成像识别。

图4 拉曼标签用于细胞的成像图。(a)溶酶体成像图及所用标签(Lyso-P1)的拉曼光谱图；(b)线粒体成像图及所用标签(Mito-P2)的拉曼光谱图;(c)内质网成像图及所用标签(ER-P3)的拉曼光谱图；(d)细胞膜成像图及所用标签(CM-P8)的拉曼光谱图Fig.4 Raman imaging of subcellular organelles by Raman-active codes. (a) Raman imaging of lysosome by Lyso-P1; (b) Raman imaging of mitochondria by Mito-P2; (c) Raman imaging of ensoplasmic reticulum by ER-P3; (d) Raman imaging of cell membrane by CM-P8

4 结论

在本研究中，我们制备出了十五种拉曼信号输出各异的多色拉曼标签，主要是采用两种合成策略，其一是改变三键单体的分子结构，其二是利用两种不同的三键分子的单体进行共聚合，并对两种三键分子的拉曼散射的强度进行了编码调节。首次实现了三键分子的拉曼强度编码在纳米单粒子上，制备出了拉曼散射各异的拉曼标签，拉曼标签呈单分散的纳米粒子，粒径均一，且拉曼信号稳定。选用四种拉曼标签分别与亚细胞器和肿瘤细胞膜靶向的小分子结合，实现了亚细胞器和肿瘤细胞膜的成像。