马平，王嘉晨，高翔，羊阳，朱亚平，马国荣，杜送田 安建科

(兰州生物制品研究所有限责任公司菌苗三室，甘肃省疫苗工程技术研究中心，甘肃 兰州 730046)

约95%的侵袭性流感嗜血杆菌疾病由 b 型引起，b型流感嗜血杆菌[1](Haemophilusinfluenzaetypeb，Hib)侵袭性疾病主要表现为脑膜炎(约占50%～65%)，也可表现为肺炎、败血症、蜂窝组织炎、会厌炎、关节炎、骨髓炎和心包炎等[1-7]。为了提高b型流感嗜血杆菌分离与鉴定，需选择适宜其生长的培养基。该细菌的氧化还原酶系统不完善，人工培养时需要添加两种辅助因子(X因子和V因子)[8-12]。“X”因子存在于血红蛋白中，是血红素及其衍生物，是细菌合成过氧化物酶、细胞色素氧化酶等呼吸酶的辅基，可耐115 ℃高温；“V”因子是辅酶Ⅰ(β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate，NAD)或Ⅱ，在细菌呼吸中起递氢体作用，耐热性较差[13-15]。新鲜动物血液中含有X因子和V因子[16]，故临床上通常使用马血、兔血及羊血制备的巧克力培养基来分离培养b型流感嗜血杆菌及其他致病菌，但发现羊血相比兔血、马血制备的巧克力培养基培养b型流感嗜血杆菌的检出率较差[17-18]。考虑易获得性与经济性，商品化的无菌脱纤维羊血最易买到。羊血巧克力培养基上b型流感嗜血杆菌检出率较差可能受培养基制备工艺和条件的影响，为了深入研究羊血巧克力培养基上b型流感嗜血杆菌检出率较差的原因，以及期望找到优化的羊血巧克力制备方法，使Hib可以在羊血巧克力培养基上生长良好，扩展羊血在Hib分离鉴定所需培养基中的应用，试验研究了b型流感嗜血杆菌在不同方法制备的羊血巧克力培养基上的生长情况。通过培养基中羊血含量的浓度、培养基加热温度以及添加辅酶的浓度证明了羊血含有丰富的NAD，只是制备巧克力培养基过程中羊血含有的NADase酶会完全破坏NAD，只有后期补加NAD或者先消除NADase的破坏作用，b型流感嗜血杆菌在羊血巧克力培养基上则生长良好。

1 材料与方法

1.1 试验菌种

b型流感嗜血杆菌CMCC58547购自中国食品药品检定研究院。

1.2 主要试剂及仪器

脱纤维绵羊全血购自兰州民海生物工程有限公司；酵母浸粉FM888购自安琪酵母股份有限公司；葡萄糖购自潍坊盛泰药业有限公司；琼脂粉、十二水合磷酸氢二钠和二水合磷酸二氢钠均购自国药集团化学试剂有限公司；NAD购自PanReac AppliChem公司；中国细菌浊度标准国家标准品购自中国食品药品检定研究院；SHHW21.600电热恒温三用水浴箱购自北京市永光明医疗仪器有限公司；BCM-1000A生物洁净工作台购自苏州安泰空气技术有限公司；电热恒温培养箱购自黄石市恒丰医疗器械有限公司；MF3菌落计数仪购自杭州迅数科技有限公司；移液器购自德国Eppendorf公司。

1.3 试验方法

1.3.1 羊血巧克力培养基的制备 培养基配方如下：酵母浸粉 1%、十二水合磷酸氢二钠 2.865%、二水合磷酸二氢钠 0.312%、琼脂粉 1.5%、葡萄糖 1%、六水合氯化镁 0.203%、5%～10%脱纤维羊血(体积比)，0.1～0.4 μg/mL NAD(仅95 ℃制备方法使用)。

1.3.1.1 85 ℃制备方法 称取琼脂粉、十二水合磷酸氢二钠和二水合磷酸二氢钠加注射用水溶解后，121 ℃、15 min 高压灭菌，冷却至60 ℃左右加入除菌的酵母浸粉-葡萄糖-氯化镁溶液和终浓度为5%、7.5%和10%脱纤维羊血，然后置于85 ℃水浴中摇动15 min，使其变成巧克力色，冷却到50 ℃ 左右后倾注平板。

1.3.1.2 95 ℃制备方法 称取琼脂粉、十二水合磷酸氢二钠和二水合磷酸二氢钠加注射用水溶解后，121 ℃、15 min 高压灭菌，冷却至60 ℃左右加入除菌的酵母浸粉-葡萄糖-氯化镁溶液和终浓度为5%、7.5%和10%脱纤维羊血，然后置于 95 ℃ 水浴中摇动15 min，使其变成巧克力色，冷却到50 ℃ 左右后倾注平板。

1.3.1.3 85 ℃含NAD制备方法 称取琼脂粉、十二水合磷酸氢二钠和二水合磷酸二氢钠加注射用水溶解后，121 ℃、15 min 高压灭菌，冷却至60 ℃左右加入除菌的酵母浸粉-葡萄糖-氯化镁溶液和终浓度为5%、7.5%和10%脱纤维羊血，然后置于 85 ℃ 水浴中摇动15 min，使其变成巧克力色，冷却到50 ℃ 左右再加入终浓度为0.1、0.2、0.4 μg/mL除菌的NAD溶液，混匀后倾注平板。

1.3.1.4 兔血平皿的制备 称取琼脂粉、十二水合磷酸氢二钠和二水合磷酸二氢钠加注射用水溶解后，121 ℃、15 min 高压灭菌，冷却至60 ℃左右加入除菌的酵母浸粉-葡萄糖-氯化镁溶液和脱纤维兔血，然后置于85 ℃水浴中摇动15 min，使其变成巧克力色，冷却到50 ℃ 左右后倾注平板。

1.3.2 b型流感嗜血杆菌菌悬液的制备 刮取生长良好的b型流感嗜血杆菌菌落，悬浮于生理盐水中，配制细菌浓度约为23 亿/mL的菌悬液。

1.3.3 b型流感嗜血杆菌的生长情况考察 将上述菌悬液稀释106倍后取0.1 mL均匀涂布于巧克力琼脂平板上，不同制备方法制备的巧克力琼脂培养基均平行接种 6 块平板，置于35～37 ℃电热恒温培养箱培养24 h，使用MF3菌落计数仪统计得菌落平均直径(mm)。

1.4 统计学分析

应用SPSS 25.0软件对数据进行统计学分析，所得数据组间比较采用单因素方差分析，当P<0.05时，两组数据间差异有统计学意义；当P>0.05时，两组数据间差异无统计学意义。

2 结果与分析

2.1 水浴温度为85 ℃制备的羊血巧克力培养基上b型流感嗜血杆菌生长情况

水浴温度为85 ℃制备的不同含量羊血巧克力培养基与兔血巧克力培养基上b型流感嗜血杆菌生长情况见表1。培养24 h后，可见b型流感嗜血杆菌在兔血巧克力平板上生长良好，菌落平均直径为1.52 mm，见图1。b型流感嗜血杆菌在水浴温度为85 ℃制备的不同含量羊血巧克力培养基上均不生长。

图1 b型流感嗜血杆菌在5%兔血巧克力培养基生长情况

表1 水浴温度为85 ℃制备的巧克力培养基上b型流感嗜血杆菌生长情况比较

2.2 水浴温度为95 ℃制备的羊血巧克力培养基上b型流感嗜血杆菌生长情况

水浴温度为95 ℃制备的不同含量羊血巧克力培养基上b型流感嗜血杆菌生长情况见表2。水浴温度95 ℃制备的羊血巧克力培养基，含5%羊血巧克力培养基上b型流感嗜血杆菌的菌落直径为(1.08±0.09)mm，菌落平均生长数为93±6(图2-A)，含7.5%羊血巧克力培养基上b型流感嗜血杆菌的菌落直径为(1.32±0.10)mm，菌落平均生长数为152±7(图2-B)，含10%羊血巧克力培养基上b型流感嗜血杆菌的菌落直径为(1.46±0.12)mm，菌落平均生长数为176±9(图2-C)；水浴温度95 ℃制备的不同含量羊血巧克力培养基上b型流感嗜血杆菌的菌落直径和生长率随着羊血含量增加而增加，差异有统计学意义(P=0.002 353，P<0.05)，10%羊血巧克力培养基上的菌落直径和生长率与兔血巧克力培养基相比差异无统计学意义(P=0.489 63，P>0.05)。

A：5%；B：7.5%；C：10%

表2 水浴温度为95 ℃制备的羊血巧克力培养基上b型流感嗜血杆菌生长情况

2.3 水浴温度为85 ℃后续补加不同浓度辅酶I(NAD)的羊血巧克力培养基上b型流感嗜血杆菌生长情况

水浴温度为85 ℃后续补加不同浓度辅酶I(NAD)的羊血巧克力培养基上b型流感嗜血杆菌生长情况见表3。在水浴温度为85℃后续补加终质量浓度0.1 μg/mL辅酶I(NAD)的不同含量羊血巧克力平板上，b型流感嗜血杆菌几乎不生长。水浴温度为85 ℃后续补加终质量浓度0.2 μg/mL与0.4 μg/mL辅酶Ⅰ(NAD)的羊血巧克力平板上，b型流感嗜血杆菌菌落直径和生长率均良好，与兔血巧克力培养基差异无统计学意义(P=0.612 8，P>0.05)，NAD终质量浓度0.2 μg/mL和0.4 μg/mL之间差异无统计学意义(P=1，P>0.05)，不同含量羊血之间差异无统计学意义(P=0.273 102，P>0.05)。

表3 水浴温度为85 ℃后续补加不同浓度辅酶I(NAD)的羊血巧克力培养基上b型流感嗜血杆菌生长结果

A：0.2 μg/mL NAD；B：0.4 μg/mL NAD

3 讨论与结论

动物血液的红细胞中存在大量“V”因子，红细胞完整时，血液中的“V”因子并不能被b型嗜血杆菌利用，因此b型流感嗜血杆菌在鲜血平皿上不生长。当将b型流感嗜血杆菌及金黄色葡萄球菌一起接种至鲜血平皿时，因金黄色葡萄球菌可引起溶血，使鲜血平皿中的红细胞被破坏，释放出“V”因子，故金黄色葡萄球菌菌落附近的b型流感嗜血杆菌菌落较大，远离金黄色葡萄球菌的b型流感嗜血杆菌菌落较小或无菌落。该现象被称为“卫星现象”，常被用来检定流感嗜血杆菌。当血液被加热到85 ℃左右时，红细胞也可被破坏，V因子充分释放并发挥作用[18]，此时血颜色变为巧克力色，故Hib在巧克力培养基上生长较佳。

使用马血、兔血或羊血制备的巧克力培养基，Hib在羊血巧克力培养基上生长的比兔血或马血巧克力培养基上更差[19-20]。本试验就b型流感嗜血杆菌在不同动物血培养基的生长情况进行研究后发现，b型流感嗜血杆菌在85 ℃加热制备的兔血巧克力平板上生长良好，菌落平均直径为1.52 mm；而在85 ℃加热制备的羊血巧克力培养基上不生长。这是由于羊血中含有快速水解V因子的NADase酶导致羊血巧克力培养基由于缺乏NAD来支持Hib细菌的生长，而兔血中不含有这种酶类不受影响。

NADase酶广泛存在于许多微生物、动物的各种组织和毒液中，能催化水解NAD为等摩尔的尼克酰胺和腺嘌呤二磷酸核糖。选择一个适中的温度95 ℃加热羊血使其中的NADase活性消失，NAD也在此温度下不被彻底破坏[21]。试验2中水浴温度95 ℃制备的不同含量羊血巧克力培养基上，b型流感嗜血杆菌的菌落直径和生长率随着羊血含量增加而增加，差异有统计学意义(P<0.05)，10%羊血巧克力培养基上的菌落直径和生长率与兔血巧克力培养基相比差异无统计学意义(P>0.05)。这是因为有95 ℃加热破坏羊血中水解V因子的NADase酶，从而保留V因子活性，但由于V因子不耐高温，95 ℃加热过程中V因子有损失，必须增加羊血含量才能提供足量的“V”因子以供b型流感嗜血杆菌正常生长。依次提高羊血巧克力培养基中羊血含量，从5%至10%菌落直径从(1.08 ±0.09)mm增加为(1.46±0.12)mm，菌落平均生长数从93±6到176±9；可以看出添加10%以上羊血制备的巧克力培养基上的菌落直径和生长率与兔血巧克力培养基相当。羊血巧克力培养基中缺乏NAD并不是因为羊血本身缺乏足够的NAD导致，而是因为羊血巧克力培养基制备过程V因子均被破坏而无法发挥作用，后期补加NAD可以弥补其缺乏[22]。试验3证明补加0.2 μg/mL以上NAD之后b型流感嗜血杆菌在羊血巧克力培养基才生长良好。补加0.1 μg/mL NAD条件下，随着羊血含量增加b型流感嗜血杆菌几乎不生长；补加0.2 μg/mL与0.4 μg/mL NAD之后b型流感嗜血杆菌生长良好，菌落直径与生长个数无明显差异。综合考虑各培养基制备方法与配方后，羊血添加量为5%、水浴温度为85 ℃后续补加0.2 μg/mL辅酶I(NAD)制备的巧克力培养基是较优选择。考虑NAD的价格及NAD需除菌后加入，从操作便利性来说，添加10%羊血、水浴温度为95 ℃制备巧克力培养基是一种操作简便，且无需除菌所需设备、耗材和费用的方法。

本研究通过对羊血巧克力培养基制备工艺进行优化，使b型流感嗜血杆菌可以在羊血巧克力培养基上生长良好，菌落直径与菌落生长数大幅提高。为羊血巧克力工艺优化提供了借鉴意义，并且拓展了羊血在Hib分离鉴定所需培养基中的应用。