汪飞 唐婷玉 刘娟 黄河 李志军

阻塞性睡眠呼吸暂停（obstructive sleep apnea，OSA）由于上呼吸道完全或部分阻塞，反复出现睡眠呼吸暂停及睡眠结构紊乱，可导致间歇低氧和睡眠片段化，是高血压、肿瘤、糖尿病等疾病的独立危险因素，影响患者的生活质量甚至缩短寿命[1]。流行病学研究表明，OSA在成人中的发病率为26%，且近年来随着肥胖人数的增加而逐渐升高[2]。目前，OSA被认为是全身性高血压的重要危险因素，约50%OSA患者存在高血压[3]。已有研究证实OSA与高血压之间关系密切[4]，至于OSA引起高血压的机制仍不十分清楚，但近年来越来越多的研究开始关注肠道菌群改变引起OSA导致高血压的发生。目前关于有效治疗OSA仍存在以下困难：（1）临床上缺乏疗效确切的治疗药物；（2）无创通气作为OSA的一线治疗方法存在患者依从性差的问题；（3）口腔矫正器也是如此，而且约80%患者治疗后存在唾液多、口腔干燥、颞下颌关节疼痛和牙齿不适感等不良反应；（4）部分患者虽可采取手术治疗，但远期疗效欠佳。因此，临床治疗OSA合并高血压仍有一定的难度。本研究旨在探讨肠道菌群多样性改变与OSA合并高血压发病的关系，为筛选特异性肠道微生物作为潜在的治疗靶点提供实验依据。

1 对象和方法

1.1 对象 收集2018年7月至2021年6月浙江医院睡眠障碍中心收治的鼾症患者46例，均已接受夜间多导睡眠图（polysomnography，PSG）监测。依据PSG结果分为OSA组32例和对照组14例，其中对照组无其他重大基础疾病，OSA组除高血压外无其他重大基础疾病。根据是否合并高血压，将OSA组分为OSA合并高血压患者11例及单纯OSA患者21例。纳入标准：（1）根据中国医师协会睡眠医学专业委员会制定《成人阻塞性睡眠呼吸暂停多学科诊疗指南（2018年版）》，PSG检查提示呼吸暂停低通气指数（apneahypopnea index，AHI）≥5，同时伴有典型的夜间睡眠打鼾伴呼吸暂停、日间嗜睡便可诊断OSA[1]；（2）根据《中国高血压防治指南2018年修订版》，在未使用降压药物的情况下，诊室收缩压（SBP）≥140 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）和（或）舒张压（DBP）≥90 mmHg便可诊断高血压[5]。排除标准：（1）年龄＜18 周岁；（2）颌面部严重畸形；（3）患有可影响血氧饱和度的相关疾病，如慢性阻塞性肺疾病、心功能不全等；（4）患有可能会导致肠道菌群失调或影响炎症因子分泌的相关疾病，如炎症性肠病、糖尿病、肿瘤、风湿免疫性疾病等；（5）正在服用可影响睡眠的药物，如苯二氮卓类药物、镇静剂等；（6）已经进行 OSA相关治疗；（7）PSG睡眠时间＜5 h；（8）近2周内接受益生菌、抗生素或免疫抑制剂治疗。OSA合并高血压组均为男性，平均年龄（40.5±10.2）岁；单纯OSA组男19例，女 2例，平均年龄（37.9±10.4）岁；对照组男 5例，女 9例，平均年龄（42.3±10.3）岁；3组患者年龄比较差异无统计学意义（P＞0.05），但性别比较差异有统计学意义（P＜0.05）。本研究经本院医学伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 PSG监测 采用SOMNO screen plus PSG+（V5）（德国施曼诺公司）多导睡眠监测仪监测，监测时间≥5 h。记录AHI、微觉醒指数、最低血氧饱和度、平均血氧饱和度及氧减指数。

1.2.2 肠道菌群检测及分析 于PSG监测结束后当日清晨收集3组患者的粪便，采用QIAamp DNA Stool Mini试剂盒（德国 Qiagen公司，型号：Qiagen51604），按照试剂盒说明书提取粪便总细菌DNA，-80℃保存备用。对采集的样本DNA进行16S rRNA基因PCR扩增，纯化PCR产物并放入NGS测序仪（美国Illumina公司，型号：MiSeq PE300）进行测序、建库、簇制备和比对，获得菌群信息。经过筛选，最终单样本序列数超过40 000条。将相似度＞97%的序列归为同一个分类操作单元（operational taxonomic unit，OTU），最终产生759个OTU。采用韦恩图分析3组患者OTU的差异。α多样性分析用来评估菌群的丰度和多样性，β多样性分析用来评估3组样本的菌群多样性差异。采用主成分分析（principal component analysis，PCA）比较3组患者样本菌群组成差异，以三维坐标图呈现。坐标图上三点距离越近，代表样本菌群组成越相似。通过Metastats分析在不同水平上比较3组患者菌群的差异。

1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0和R24、GraphPad Prism 5.0统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q法；计数资料组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。采用Wilcoxon秩和检验分析多样性指数的差异。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组患者PSG监测结果的比较 3组患者在AHI、微觉醒指数、最低血氧饱和度、平均血氧饱和度及氧减指数的比较差异均有统计学意义（均P＜0.01），OSA合并高血压组、单纯OSA组各项监测指标均高于对照组，OSA合并高血压组最低血氧饱和度、平均血氧饱和度低于单纯OSA组，其余指标均高于单纯OSA组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

表1 3组患者PSG监测结果比较

2.2 3组患者OTU的差异 3组共有402个OTU，单纯OSA组与对照组共有84个OTU，OSA合并高血压组与对照组共有24个OTU，OSA合并高血压组与单纯OSA组共有48个OTU，OSA合并高血压组有34个特有OTU，单纯OSA组有86个特有OTU，对照组有81个特有OTU，见图1。

图1 韦恩图分析3组患者OTU的差异

2.3 菌群积累情况与菌群多样性分析 根据样本数量和菌群，α多样性分析（Rank丰度分布曲线、样本稀疏曲线、香农曲线和菌群积累曲线）提示随着样本数量的增加，菌群的多样性和丰度并没有明显的增加，表明目前的样本量能够反映菌群多样性丰富程度，所有样本的菌群积累曲线见图2（插页）。3组患者肠道微生物菌群的多样性和丰度（主要包括Observed指数、Chao1指数、ACE 指数、Shannon指数、Simpson指数和Coverage指数）见图3，结果发现，与对照组相比，OSA合并高血压组及单纯OSA组患者肠道菌群的多样性和丰度降低了，但3组间差异无统计学意义（P＞0.05）。PCA分析表明，OSA合并高血压组、单纯OSA组肠道菌群发生改变（图4，见插页）。

图2 菌群积累曲线（a：Rank丰度分布曲线用来反映菌群丰度和多样性；b：稀疏曲线用来反映菌群的丰度；c：香农指数反映菌群的多样性；d：菌群积累曲线用来反映菌群的丰度）

图3 3组患者肠道微生物菌群的多样性和丰度分析

图4 3组患者粪便菌群的PCA分析

2.4 菌群差异分析 对3组患者所有样本进行分类，选取菌群丰度最高的30个菌群，分析门、纲、目、科、属、种水平上的分布差异。结果显示，门水平Bacteroidetes在对照组中丰度高于OSA合并高血压组、单纯OSA组，而Firmicutes丰度在OSA合并高血压组占比最高；纲水平Bacteroidia在对照组中丰度最高，而Clostridia在OSA合并高血压组中丰度最低；目水平Bacteroidales在对照组中丰度最高，而Clostridiales在OSA合并高血压组中丰度最低；科水平Bacteroidaceae、Ruminococcaceae在对照组中丰度最高，Prevotellacea在单纯OSA组中丰度最高，而Lachnospiraceae、Veillonellaceae、Enterobacteriaceae 在 OSA合并高血压组中丰度最高；属层级Bacteroides在对照组中丰度最高、Lachnospiracea_incertae_sedis、Clostridium_XlVa、Blautia在OSA合并高血压组中丰度最高，Prevotella在单纯OSA组中丰度最高。Metastats分析结果显示，对照组、单纯OSA组及OSA合并高血压肠道菌群差异均有统计学意义（均P＜0.05）。在门水平上，对照组的Bacteroidetes丰度最高，Firmicutes显著降低；而OSA合并高血压组的Firmicutes最高，Bacteroidetes丰度显著降低。在纲水平上，Bacteroidia在对照组中丰度最高而在OSA合并高血压组中丰度最低。在目水平上，Bacteroidales在对照组中丰度最高而Actinomycetales在OSA合并高血压组中丰度最低。在科水平上，Rikenellaceae在对照组中丰度最高，而Micrococcaceae、Clostridiaceae_1、Carnobacteriaceae 在OSA合并高血压组中丰度最高。在属水平上，Alistipes在对照组中丰度最高而 Rothia、Scardovia、Clostridium_sensu_stricto、Granulicatella、Weissella、Blautia在 OSA合并高血压组中丰度最高。在种水平上，Alistipes_shahii、Clostridium_leptum、Alistipes_indistinctus、Bacteroides_massiliensis、Ruminococcaceae_bacterium_GD6在对照组中丰度最高，而Scardovia_wiggsiae在OSA合并高血压组中丰度最高。

3 讨论

近年来的研究表明，肠道微生物的变化与多种慢性疾病有关。Fang等[6]研究发现炎症性肠病患者肠黏膜相关菌群发生改变，也有研究报道肠道微生态组成和代谢改变可以用来评估强直性脊柱炎等疾病的发生和发展[7]。有实验数据显示，肠道菌群失调介导炎症反应导致血压升高[8]。另有研究表明，肠道微生态改变可使促炎因子增多，抑炎因子减少，导致高血压的发生[9]。近年来，越来越多的研究开始关注OSA与肠道菌群的关系。有动物模型研究发现OSA大鼠肠道微生物群落结构发生显著改变[10]。本研究显示OSA患者肠道菌群发生改变，与上述研究结果相符。

现今较多研究显示OSA可出现肠道菌群种类及结构的改变，但关于OSA肠道菌群结构改变特点，目前暂无公认的科学研究证实。Moreno-Indias等[11]通过OSA动物模型研究发现OSA大鼠出现肠道菌群结构显著改变，主要表现为厚壁菌门丰度增多，拟杆菌及变形菌门丰度减少。Poroyko等[12]研究揭示慢性睡眠中断可导致肠道微生态结构改变。本研究发现OSA患者与对照组相比，肠道微生物群发生改变，Bacteroidetes在对照组人群中丰度较高，而Firmicutes在OSA人群中丰度较高，与上述研究报道一致。

虽然OSA与高血压之间的关系已经得到了明确的证实，但对于OSA如何导致高血压却知之甚少。有研究显示，OSA会导致高血压的发生，经过持续气道正压通气治疗后血压会有所下降[13]。近年来的研究表明，肠道微生物群改变在OSA合并高血压的发病机制中扮演重要的调节作用[14]。有实验表明，肠道菌群失调可导致高血压的发生、发展[15]。Mashaqi等[16]报道了肠道菌群失调介导OSA大鼠发生全身性高血压，并且认为肠道菌群改变是OSA合并高血压病理生理学的重要因素。Durgan等[17]在OSA大鼠模型中进行的研究揭示，肠道菌群失调参与了OSA合并高血压的发生，而且发现与对照组相比，OSA大鼠肠道菌群结构发生改变，介导了炎症反应，表明肠道菌群失衡在OSA合并高血压的发生、发展中起重要作用。本研究结果显示，在门、纲、目水平上，OSA合并高血压组与单纯OSA组、对照组相比，Firmicutes丰度最高，Bacteroidetes丰度显著降低，存在Bacteroidetes/Firmicutes菌群紊乱，与以上研究结果相似。Bacteroidetes和Firmicutes是肠道微生物的两大重要类群，Bacteroidetes/Firmicutes比值的紊乱可导致肠道屏障破坏，促进炎症反应。本研究还显示在科、属、种水平上，OSA合并高血压组存在其它一些肠道菌群结构异常，以往文献及研究较少报道，但可能提示参与OSA合并高血压的发生、发展，由于该研究为单中心临床试验，纳入的临床病例数非常有限，该结论需要进一步研究以明确。因此，未来还需要开展多中心前瞻性临床对照试验，进一步分析论证。

本研究也存在一些不足之处。首先，本研究为单中心临床研究，且样本量偏少，然而目前的样本量能够反映菌群丰富程度，且PCA分析及Metastats分析结果均显示对照组、单纯OSA组及OSA合并高血压肠道菌群差异均有统计学意义（均P＜0.05），故仍能表明OSA合并高血压患者发生肠道菌群多样性改变。其次，本研究仅观察了对照组、单纯OSA组及OSA合并高血压肠道菌群结构存在明显差异，未能进一步对OSA患者进行无创呼吸机治疗并治疗前后肠道菌群多样性的变化，尤其是针对OSA合并高血压患者，需要进一步研究证实肠道菌群多样性改变与OSA及高血压之间的因果关系。

综上所述，本研究发现Firmicutes在OSA合并高血压人群中丰度最高，Bacteroidetes在对照组中丰度较高；肠道菌群多样性改变参与OSA合并高血压的发生、发展。本研究结果为未来将调节肠道微生物群紊乱作为治疗OSA合并高血压提供一定实验依据。