张黎军 赵盼盼 徐志秀 王凡 王朔 任静 袁彬 吉四辈

星形胶质细胞是胶质细胞中体积最大的一种，在哺乳动物脑内分布最为广泛，在血脑屏障形成、神经系统调节中起到重要作用[1]。有研究显示，星形胶质细胞在细胞迁移中参与了神经退行过程[2]，在中枢神经系统中发挥了传递神经递质等多种生物学作用。星形胶质细胞可以在帕金森病患者及帕金森病动物模型中呈现出活化状态，在病理状态下其线粒体功能受损[3]。胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）表达上调是活化状态的主要表现，若抑制GFAP的表达，神经损伤后轴突再生功能会大幅度降低。李燕华等[4]研究结果表明，慢病毒转染基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-9会下调水通道蛋白4（aquaporin 4，AQP4）的表达，这可为利用星形胶质细胞进行缺血性脑水肿实验提供参考。MMP-2、MMP-9均属于基质金属蛋白酶家族[5]，两者在细胞中发挥着重要作用[6]。蛋白质磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）是一种异源三聚体蛋白，能够参与多种生物学功能的调节。有研究表明，PP2A升高对转基因损伤小鼠神经功能有一定的改善作用[7]，p38是丝裂原活化蛋白激酶中重要成员，参与细胞信号转导过程[8-9]。本研究探讨PP2A激活剂对星形胶质细胞迁移能力的影响及相关作用机制，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 （1）实验动物：选取出生48 h内健康、清洁级SD雄性大鼠，均由华北理工大学科学院提供[许可证号：SYXK（冀）2020-007]。饲养温度 20～25 ℃，湿度为50%，人工饲养3 d。（2）主要试剂：大鼠抗小鼠磷酸化 p38（phosphorylation of p38，p-p38）抗体由武汉益普生物科技有限公司提供，PP2A活性试剂盒由上海瓦兰生物科技有限公司提供；人抗大鼠MMP-2抗体、MMP-9抗体由上海恒斐生物科技有限公司提供。本研究经医院医学伦理委员会批准（批准文号：21000092017072）。

1.2 方法

1.2.1 星形胶质细胞培养 参照张黎军等[10]星形胶质细胞的培养方法：采用75%乙醇对大鼠消毒，以断颈法处死，快速将大鼠大脑组织取出并放置在平皿中，连续洗涤3次，提取大鼠大脑皮层组织，剥除血管膜并剪碎，加入0.125%胰蛋白酶2 ml消化15 min，每3 min进行1次摇晃，待其完全消化后，将其置于含有10%FBS的杜尔贝科伊格尔培养基（Dulbecco's modified eagle medium，DMEM）中，加入适量细胞培养液使细胞悬浮，随后在细胞培养瓶中培养，培养环境为5%CO2、37℃。每3 d更换1次培养液，9 d后密封培养瓶，置于37℃摇床中，待细胞分离后检测胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GEAP）表达，若检测阳性，即提示星形胶质细胞培养完成。更换培养液，重复以上步骤，选取第2代星形胶质细胞备用。

1.2.2 细胞分组 将培养后的第2代星形胶质细胞分为抑制组、激活组、对照组3组。抑制组加入15 nmol/L PP2A抑制剂冈田酸；激活组加入15 nmol/L PP2A激活剂鞘胺醇（d-erythro-sphingosine，DES）；对照组加入等体积二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），每组细胞在用乙二胺四乙酸胰酶消化后，以5×104/ml的密度接种在铺有盖玻片（预先采用多聚赖氨酸包被）的6孔板内，在5%CO2、37℃下恒温培养箱内培养48 h后，备用。

1.2.3 PP2A活性检测 采用放射免疫沉淀法，3组细胞均加入细胞裂解液，在冰上裂解20 min后转移至微型离心管（micro centrifuge tube，EP）中，在 4 ℃下离心处理10 min，分离蛋白上清液后在EP内保存，采用二喹啉甲酸蛋白试剂盒检测蛋白浓度，滴加50 μg蛋白样品后，采用PP2A活性检测试剂盒完成PP2A活性检测。

1.2.4 星形胶质细胞迁移率的观测 采用细胞染色观察法。采用胰蛋白酶将3组细胞完全消化，分别滴加含有1%FBS培养悬液细胞，细胞浓度为1×105个/ml，在 Transwell小室上室中加入 500 μl细胞悬液，在Transwell小室下室中加700 μl 10%的FBS细胞液，将Transwell小室放置在12孔板上，培养8 h后，使用棉签将上层多余细胞擦掉，固定5 min。采用日本奥林巴斯BX43光学显微镜观察细胞迁移数目，在25℃下使用Giemsa染料染色15 min后统计迁移总细胞数目，并计算细胞迁移率，细胞迁移率=迁移总细胞数目/膜下层细胞×100%，重复上述步骤3次，取平均值。

1.2.5 p-p38、MMP-2、MMP-9的检测 采用电泳洗涤法。提取3组细胞中总蛋白，加入5×十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate crystals，SDS）上样缓冲液，每孔剂量20 μg。于120 V电压下，电泳1.5 h至形成聚偏二氟乙烯膜后，采用5%脱脂奶粉封闭，加入一抗Tris-HCl缓冲盐溶液（TBS with tween-20，TBST），p-p38、MMP-2、MMP-9按照1:2 000稀释或在温室下孵育12 h后在4℃条件下进行震荡过夜，再次洗涤，加入二抗溶液 TBST，p-p38、MMP-2、MMP-9 按照 1∶5 000 稀释，震荡120 min后，洗涤，显色成像，使用Image J软件分析蛋白条带灰度值。GAPDH作为内参蛋白。

1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件，计量资料以表示，多组间比较采用方差分析，组间比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组细胞PP2A活性比较 3组细胞PP2A活性比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。抑制组PP2A活性51.22±8.98，低于激活组的135.89±11.25及对照组的102.15±10.15，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；激活组PP2A活性高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 3组细胞迁移率的比较 3组细胞迁移率比较差异有统计学意义（P＜0.05）。抑制组细胞迁移率0.15±0.02，低于激活组的0.42±0.03及对照组的 0.23±0.01，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；激活组细胞迁移率高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。光学显微镜下3组细胞迁移情况见图1。

图1 光镜下3组细胞迁移情况（×100）

抑制组细胞外基质内的细胞迁移数目低于激活组、对照组；激活组细胞外基质内的细胞迁移数目高于对照组。

2.3 3组细胞中 p-p38、MMP-2、MMP-9 表达水平比较 3组细胞中p-p38、MMP-2、MMP-9表达水平比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。抑制组pp38表达水平高于对照组、激活组，激活组p-p38表达水平低于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。抑制组MMP-2、MMP-9表达水平均低于对照组、激活组，差异均有统计学意义（t=22.360、12.280、17.000、12.330，均 P＜0.05）；激活组 MMP-2、MMP-9 表达水平高于对照组，差异均有统计学意义（t=7.000、3.796，均P＜0.05），见表 1。3 组 p-p38、MMP-2、MMP-9 表达水平比较见图2、图3。

表1 3组细胞中p-p38、MMP-2、MMP-9表达水平比较

图2 3组p-p38蛋白表达的电泳图

图3 3组MMP-2、MMP-9表达的电泳图

3 讨论

星形胶质细胞与神经系统关系密切，对神经细胞的生长具有一定的营养作用，在神经系统中具有广泛的生物学功能[11]。李昕华等[12]研究结果表明，处理后的星形胶质细胞分泌胶质细胞源性神经营养因子能起到抑制p38MAPK信号通路的作用，并且抑制神经元细胞的减少，发挥保护脑神经的作用。

PP2A含有较大数量的三聚体，对细胞中多种蛋白能起到直接作用，在多种生物学功能中发挥关键作用[13]。有研究表明，其活性的降低能够破坏神经元轴突功能的发挥[14]。本研究结果显示，激活组PP2A活性明显高于抑制组、对照组，此结果说明，PP2A激活剂能提高机体中PP2A活性。细胞迁移属于一种细胞运动，在多种过程中均发挥着重要作用，如伤口愈合、癌症进展、免疫反应等[15]。本研究结果显示，激活组细胞迁移率明显高于抑制组、对照组，此结果说明，PP2A激活剂能够显著促进星形胶质细胞迁移，从而提高星形胶质细胞迁移的能力。李夏春等[16]研究结果表明，上调PP2A能够改善淀粉样前体蛋白/早老蛋白-1双转基因小鼠病理改变，具有改善学习记忆能力的作用，与本文研究结果一致。赵鑫等[17]研究中，采用Transwell小室细胞迁移实验和细胞划痕实验检测小干扰RNA调节ski基因（ski gene-small interfering RNA，ski-siRNA）转染后星形胶质细胞迁移能力的变化发现，ski-siRNA转染组每孔迁移细胞数少于空白对照组和阴性对照组。细胞划痕实验显示,转染组细胞1～5 d的划痕愈合率均明显低于对照组，证实沉默ski基因能显著抑制星形胶质细胞的迁移能力。

MMP-2、MMP-9两者在细胞中发挥着重要作用。卢文玉等[18]研究结果表明，ApoE能够调节胶质细胞分泌的MMP-9表达，影响血脑屏障完整性。本研究结果显示，激活组中MMP-2、MMP-9表达水平明显高于抑制组、对照组，说明PP2A激活剂通过上调MMP-2、MMP-9表达，可促进星形胶质细胞的迁移。

p38参与细胞信号转导过程。本研究中，激活组p-p38表达量较抑制组、对照组较低，说明PP2A激活剂通过降低p-p38磷酸化水平，从而降低了p38水平。雷雨广等[19]研究结果表明，PDIA3过表达能够改善H2O2诱导的星形胶质细胞氧化应激损伤及炎性反应，其能够通过抑制p38MAPK通路的激活发挥其作用。邵广田等[20]研究结果显示，缺氧组p-p38表达显著高于正常组,而缺氧+SB203580组p-p38表达显著低于缺氧组，说明p38信号通路的激活降低了缺氧下星形胶质细胞增殖并促进细胞的凋亡，而抑制p38信号通路可提高细胞的增殖及抑制细胞的凋亡。本文研究尚未证实这一观点，因此仍需要做后续实验加以证实。

综上所述，PP2A激活剂通过调控p38MAPK信号通路，能提高星形胶质细胞中PP2A活性及星形胶质细胞迁移能力，为临床研究神经系统损伤提供理论依据。