金 燚，俞 静，夏 凡，丁国宪

南京医科大学第一附属医院老年医学科，江苏 南京 210029

随着社会经济的发展，高能量、高脂肪、低膳食纤维食物摄入显著增加，导致全球肥胖及2 型糖尿病、冠心病、脑卒中等并发症发病率逐年上升，带来了沉重的社会和经济负担。肥胖是由于长期能量摄入过多，超过能量消耗导致的。而几乎所有的能量摄入都发生在肠道［1］。目前关于高脂饮食（high fat diet，HFD）对肠道功能影响的研究，结果不完全一致［2-3］。

肠道是接触食物的重要器官，因此肠道功能紊乱是HFD 导致疾病发生的主要原因［4］。然而，许多研究忽略了肠道是由不同的区域组成，具有不同的解剖和生理功能特征。因肠道组织结构及肠道菌群分布的差异，不同肠段对营养物质的吸收也各不相同［5］，空肠是营养吸收的主要区域，而回肠在免疫调节中起更重要的作用［6］。目前尚无关于HFD对不同部位小肠功能影响的研究。

本研究通过对小鼠空回肠上皮绒毛、隐窝形态、杯状细胞数量和功能、干细胞增殖分化能力的研究，初步探讨HFD 对不同部位小肠功能的影响，为空回肠在HFD 导致的肥胖及炎症中的不同作用和机制研究提供基础。

1 材料和方法

1.1 材料

雄性C57BL/6J 小鼠40 只，8 周龄（江苏集萃药康生物科技股份有限公司），SPF级环境，温度（23±1）℃。荧光定量PCR 仪ABI7000 StepOne⁃Plus（ABI公司，美国）。生长因子EFG、R⁃spondin 1、Noggin 和Wnt3a（Pepro Tech 公司，美国），3D 培养基质Matri⁃gel 356231（Corning公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 构建HFD小鼠模型

将小鼠随机分配到正常饮食组（normal chow diet，NCD，n=20）或HFD 组（n=20），分别喂养3 个月。HFD热卡来源组成：60%由脂肪提供，20%由碳水化合物提供，20%由蛋白质提供。小鼠自由饮水，每周测量体重，记录摄食情况。

1.2.2 小肠上皮组织分离

脱颈法处死小鼠后取出整个肠道（小肠：从幽门至回盲部连接；十二指肠：距幽门5 cm；空肠：中间段小肠的中间部10 cm，回肠：靠近回盲肠部的10 cm）。

1.2.3 石蜡切片及HE染色

4%甲醛固定24 h，修剪组织后脱水，依次进行75%酒精4 h→85%酒精2 h→90%酒精1 h→无水乙醇Ⅰ30 min→无水乙醇Ⅱ30 min→醇苯5～10 min→二甲苯Ⅰ5～10 min→二甲苯Ⅱ5～10 min→蜡Ⅰ1 h→蜡Ⅱ1 h→蜡Ⅲ1 h。常规包埋。将包埋好的蜡块置于切片机上切片，4℃冰箱保存。取石蜡切片，常规脱蜡，苏木素染液3～5 min，然后伊红染液中染色5 min。常规脱水后用中性树胶封片。每组于光学显微镜下随机选取3个HE染色的区域进行观察。

1.2.4 过碘酸希夫（periodic acid⁃Schiff，PAS）糖原染色

取小鼠小肠组织石蜡切片，常规包埋、复水。样品滴加1%阿利新蓝染液（pH 2.5），室温放置10～20 min，冲洗1次，再用蒸馏水浸洗2次。滴加高碘酸溶液，室温放置10 min。再次冲洗1次，再用蒸馏水浸洗2 次。滴加Schiff 试剂，室温放置10～15 min。纯水冲洗。逐级常规乙醇脱水后中性树胶封固。每组于光学显微镜下随机选取3个PAS 染色的组织隐窝区域进行观察。

1.2.5 实时荧光定量PCR

取小鼠小肠组织，提取组织RNA，并测定RNA的含量和纯度。将RNA逆转成cDNA 为模板，用相关引物进行RT⁃PCR 扩增。实时定量PCR（ABI7000，StepOne⁃Plus，美国）。总反应体系为10 μL，反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性15 s，60 ℃退火延伸15 s，40 个循环；72～94 ℃，每升高0.5 ℃读1 次制备熔解曲线。以actin 基因作为内参，引物序列详见表1。

表1 PCR 引物序列Table 1 PCR primer seguences

1.2.6 小肠上皮分离隐窝及3D类器官培养

小鼠处死后冰上分离出10 cm肠管并纵行切开，将小肠腔面的黏液及绒毛完整刮除后，用含100 U/mL青霉素，10 mg/mL链霉素的DPBS清洗4～5次直至上清液澄清。将处理过的小肠组织放入2 mmol/L EDTA消化液中，4 ℃摇床孵育直至充分螯合（60 min），用5 mL 移液枪用力吹打，直至50%～80%的隐窝单位从固有层脱落，收集富集隐窝的吹打液，70 μm过滤，4 ℃300g离心5 min，获得隐窝沉淀。将隐窝沉淀与液体状态的基质胶Matrigel按1∶2混合，将含有隐窝单位的Matrigel 滴在24 孔培养板的孔中心，形成半球状，聚合成固态的3D立体结构。加入现配的完全培养液DMEM/F12（Gibco 公司，美国）、N2 Sup⁃plement（Life Technologies 公司，美国）、B27 Supple⁃ment（Life Technologies公司，美国）、GlutaMAX（Gibco公司，美国）、1 μmol/L N⁃乙酰半胱氨酸（Sigma⁃Al⁃drich公司，美国）、100 U/mL青霉素、100 μg/mL 链霉素（Gibco 公司，美国）、50 ng/mL EGF、1 μg/mL R⁃spondin1和100 ng/mL Noggin［7］。置于5%CO2，37 ℃细胞孵育箱培养，每天观察，每48 h更换1次培养液。

1.3 统计学方法

用GraphPad Prism 8 统计软件进行分析，数据以均数±标准差（）表示，采用t检验进行两组比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HFD导致小鼠体重显著增加

为了明确HFD 诱导的肥胖小鼠模型是否构建成功，对小鼠每周进行称重，结果显示随着HFD 时间的增加，小鼠体重明显增加，与正常饮食组有明显统计学差异（图1）。

图1 小鼠体重Figure 1 Weight of mice

2.2 HFD影响小鼠空回肠绒毛、隐窝形态

为了研究HFD是否改变小肠上皮形态，对小鼠空回肠上皮组织进行HE染色，发现与NCD组相比，HFD组小鼠尽管空回肠的绒毛长度没有明显改变，但空回肠的隐窝深度均明显变浅（P＜0.001，图2）。与NCD组相比，HFD组小鼠的空肠回肠单位面积内杯状细胞数量无明显变化（图3）。上述结果表明HFD影响了小肠上皮形态。

图2 小肠上皮组织HE染色Figure 2 HE staining images of small intestinal epithelium

图3 小肠杯状细胞PAS染色Figure 3 PAS staining images of goblet cells

2.3 HFD影响小鼠空回肠干细胞的增殖分化能力

肠道上皮隐窝底部含有活跃的肠道干细胞，是肠道上皮在成体哺乳动物各器官中更新最快的基础［8］。为探究HFD对小鼠空回肠上皮干细胞增殖分化能力的影响，利用3D类器官原代培养技术进行了体外研究（图4A）。结果显示，与NCD 组比较，培养3 d后HFD组小鼠空肠形成类器官的类隐窝区域数目减少（P＜0.05，图4B），而回肠形成类器官的类隐窝区域数目有增高趋势（图5B）。培养5 d 后，HFD组小鼠空肠形成类器官的类隐窝区域数目仍减少（图4C），而回肠形成类器官的类隐窝区域数目明显增加（P＜0.05，图5C）。以上结果表明HFD对不同区域小肠上皮干细胞增殖分化能力的影响不同。

图4 空肠3D类器官培养及形态分析Figure 4 3D organiod culture and morphological analysis of jejunum organoids

图5 回肠3D类器官培养及形态分析Figure 5 3D organoid culture and morphological analysis of ileum organoids

2.4 HFD导致小鼠空回肠上皮凋亡基因表达改变

DNA 损伤或细胞应激诱导P53 的表达，并导致细胞周期停滞、凋亡［9］。为明确HFD 对空回肠上皮细胞凋亡的作用，利用荧光定量PCR检测相关基因表达。结果发现，HFD 组小鼠空肠细胞凋亡基因P53 的表达较NCD 组显著下降（P＜0.001，图6A），而回肠细胞凋亡基因P53的表达较对照组无明显差异。回肠细胞凋亡基因Bbc3、H2afx的表达较对照组显著下降（P＜0.001、P＜0.01，图6B），而空肠凋亡基因Bbc3、H2afx的表达较对照组无明显差异（图6A），表明HFD导致小肠上皮细胞凋亡改变。

图6 小鼠空回肠凋亡基因表达Figure 6 Apoptosis gene expression in jejunum and ileum of mice

3 讨论

目前，HFD对小肠形态和功能影响的研究结果不完全一致。Beyaz等［3］发现，HFD喂养的小鼠小肠绒毛长度减少，隐窝深度增加，干细胞的数量增加、自我更新能力增强。也有研究发现，在HFD喂养的Sox9⁃EGFP小鼠空肠绒毛长度增加而隐窝深度无明显变化，杯状细胞数量减少，致使位于肠上皮表面的黏液层变薄，进而使肠道屏障保护功能下降［2］。这些不一致的研究结果可能与小鼠的品系、年龄、HFD喂养时间、含量等不同有关。

不仅如此，众所周知，小肠的不同区域具有不同的生理功能。十二指肠和空肠中的绒毛长，大部分食物的消化吸收多发生于此。而回肠绒毛较短，除了吸收胆汁盐和维生素B12 外，较少参与其他营养物质吸收［10］。与空肠相比，回肠上皮的特征是存在Peyer 斑块，含有大量淋巴细胞和其他免疫细胞的淋巴滤泡，因此在免疫学上非常活跃［6］。在本研究中发现，HFD 组空回肠的隐窝深度均明显变浅。同时，HFD 组小鼠空肠干细胞培养3 d 后分化能力下降，凋亡相关基因P53的表达显著下降，而回肠干细胞培养5 d后分化能力增加，凋亡相关基因Bbc3、H2afx表达显著下降。证实HFD不仅导致小肠对营养物质吸收代偿性减少，对空回肠干细胞增殖能力也存在差异。

小肠是人体中固定细胞更新率最快的部位之一，小肠上皮细胞不断脱落更新，并且由隐窝底部的增殖层引导［11］。而小肠上皮细胞的更新是由小肠上皮细胞凋亡，小肠干细胞的增殖和分化共同调节的。小肠干细胞的数量和功能对于小肠健康起着至关重要的作用［12］。在3D培养系统中，小肠干细胞发育成由多个细胞组成的类器官球形结构，反映了小肠干细胞的存活和增殖。并且，随着培养时间的增加，类器官生长并形成更复杂的结构，显示出腔及类隐窝，包含干细胞和所有分化的肠上皮细胞［13］。因此，类器官是评价小肠干细胞增殖和分化能力的标准。本实验通过空回肠类器官的分别培养，对不同区域小肠干细胞增殖分化能力的差异进行了研究。

已有研究表明，HFD可影响小肠干细胞微环境，导致小肠干细胞和部分祖细胞的功能发生改变［14］。小肠干细胞位于小肠隐窝基底部，隐窝深度可反映小肠干细胞活性和功能，同时小肠干细胞受隐窝及其周边细胞组成的生态位的多种信号调控［15-16］。本研究发现，虽然HFD使小鼠空回肠的隐窝深度均明显变浅，但在体外类器官培养中空回肠干细胞增殖能力无明显变化，空肠干细胞分化能力下降，而回肠干细胞分化能力增加。这种体内外研究结果的不一致，可能是小肠干细胞功能在体内时还受到周边细胞组成的生态位影响。而类器官由多种不同细胞组成，并模拟体内上皮的再生过程，更可以产生黏液，具有吸收和分泌的功能［17］。因此，相比于隐窝深度，类器官更能评估小肠干细胞的功能。饮食与肠道微生物的相互作用是通过肠道上皮实现的。本研究阐明HFD 对不同部位小肠功能的影响存在差异，为具体机制的研究提供警示，同时对后期定点监测、靶向干预饮食诱导的小肠功能改变提供理论基础。