吕李飞，吴俊松，苟江腾，赵成周，徐卫松，李忠宽，贾守宁，祁永福*

［1. 青海大学 青海省糖脂代谢疾病防控中医药重点实验室，青海 西宁 810016；2. 生物芯片北京国家工程研究中心（博奥生物），北京 102266；3. 青海大学 藏医学院，青海 西宁 810001；4. 华大基因，广东 深圳 518083；5. 青海省中医院 科研所，青海 西宁 810012］

慢性心衰（Chronic heart failure，CHF）是指各种心脏结构或功能异常，致使心室充盈或射血功能受损，心排血量不能满足机体组织代谢需要而引起的一系列综合征，是多种心血管疾病的主要死因。目前常规西药治疗已进入神经-内分泌调节的时代，沙库巴曲缬沙坦、维利西呱是临床主要用药，虽可稳定病情，但多数患者的预后仍未达期望。传统中药在慢性心系疾病的治疗过程中，经验积累颇丰，国内专家将中西药的联合干预拟定了共识指南，供研究参考[1]。

早期生长反应蛋白1（Early growth response dene 1，EGR1 ）是多种心血管系统疾病的抑制因子，EGR1的活性异常可激活下游抑制因子的功能网络，形成正反馈关系进而产生某些疾病的标志蛋白[2-3]。虚拟筛选通过模拟小分子在靶蛋白结合位点的行为来阐述基础生理过程。相比传统筛选不仅节省了劳动成本，也降低了开发成本。研究表明虚拟筛选阳性率为5% ～30%，虚拟筛选已成为最有前途的药物开发工具[4]。基因芯片将基因组学与转录组学的优势结合，可获取CHF 标志基因EGR1 的表达信息，代谢组学通过整合中药多成分、多途径的复杂调控网络，能发现并阐明巴西苏木素（Brazilin）治疗慢性心衰的物质代谢基础。本研究在虚拟筛选的基础上，联合基因芯片、代谢组学等现代生物学研究的高通量检测技术，旨在初探Brazilin 改善慢性心衰代谢紊乱的作用物质，建立虚拟筛选化合物的快速评价方式，也为虚拟筛选与多组学技术相结合的研究模式提供参考依据[5-6]。

1 基因芯片的试验研究

1.1 资料与方法

1.1.1 主要试剂及仪器 100 rxns 型真核生物多ARNA 控制试剂盒（批号：900433）、30 rxns 型真核生物杂交控制试剂盒（批号：900454）均购自美国Affymetrix 公司，−20 ℃贮存，30 rxns 型杂交、洗涤；染色试剂盒（批号：900720）购自美国Affymetrix公司，4 ℃贮存；100 rxns 型扩增试剂盒（批号：1792）购自美国Ambion 公司，−20 ℃贮存；CJT-16 型超净工作台（北京长城）；5415D 型微量台式离心机（Eppendorf中国有限公司）；TDX-1 型涡旋混合器（上海鼎国生物公司）；PTC-225 型PCR 仪（美国MJ Research公 司）；AM10027 型 磁 力 架-96（美 国Ambion 公司）；ND-1000 型紫外分光光度计 （美国NanoDrop 公司）；GDS-7600 型凝胶成像仪（美国UVP 公司）；640 型分子杂交炉、450 型基因芯片洗涤工作站、3000 型基因芯片扫描系统（美国Affymetrix 公司）。

1.1.2 研究资料及分组 研究对象均来自2018 年11 月至2020 年5 月青海省中医院。试验组为30 名符合《中国心力衰竭诊断和治疗指南2018》的患者（相应纳入、排除标准均参照指南）[1]，其中，男14 例，女16 例，平均年龄（77.00 ± 8.76）岁；对照组为30名健康人，男11 例，女19 例，平均年龄（74.30 ±8.65）岁，两组一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。本试验研究经青海省中医院伦理委员会批准（编号：qhszyy1102201601）。

1.1.3 表达谱芯片实验步骤 两组研究对象均在清晨安静空腹状态下，采用抗凝管收集前臂静脉血。随机抽取两组中各10 例外周血用于有核细胞基因表达谱的差异检测，检测方法采用Affymetrix mRNA 表达谱芯片[7]，本部分由北京博奥晶典生物技术有限公司完成。1.1.4 差异表达基因EGR1的选取 采用PrimeViewTMHuman Gene Expression Array 基因芯片检测，芯片清洗染色后AGCC 软件分析芯片的荧光图像，再通过R 语言包进行RNA 差异表达分析。差异基因设定P＜ 0.05和|log2（fold change）| ＞1.2为筛选条件。log2（fold change）＞ 1.2 为 基 因 上 调；log2（fold change）＜−1.2 为基因下调。

1.2 基因芯片结果

本研究中，CHF 患者与健康人相比，共23 497个上调基因（EGR1、CCR7、FOS、MYC等），25 125个 下 调 基 因（RAP1GAP2、STAT4、AKT1 等）。得出mRNA 中EGR1 的log2FC（Fold Change） 值 为39.397，为上调最显著的基因，也是可筛选的疾病标志基因，以EGR1为靶标的抑制剂可干预CHF，见图1。

图1 试验组vs 对照组热图Fig. 1 Heat map of text group vs control group

2 慢性心衰EGR1 靶向抑制剂的虚拟筛选

2.1 虚拟筛选条件的构建

2.1.1 化合物库的准备 本研究主要基于Sellect和Targetmol 公司的化合物实体库以及DrugBank 收录的化合物库。从https://www.selleck.cn/，https://targetmol.com/ 和https://www.drugbank.com/ 下载得到SDF 格式的化合物，再利用Schrödinger Maestro|Calculate 模块对化合物库数据进行理化性质的计算，并根据Lipinski 规则[4]过滤，筛得约30 000个化合物，最后选用力场OPLS3e 对其进行质子化和能量最小化处理。

2.1.2EGR1 蛋白结构的准备EGR1 蛋白晶体结构（PDB ID: 4R2D，Resolution: 2.15 Å）从蛋白质数据库下载(https://www.rcsb.org/structure/4R2D )。经Maestro11.9 平台处理蛋白结构，再用Schrödinger 的Protein Preparation Wizard 处理蛋白，去除结晶水，添加缺失的H 原子，并修复缺失键信息及肽段，最后对蛋白进行能量最小化和几何结构的优化[4]。

2.1.3 分子对接 采用Schrödinger Maestro的Glide模块对虚拟筛选结果进行优化，蛋白质处理采用Protein Preparation Wizard 模块，受体则进行预处理、优化。所有化合物均按LigPre 模块的默认设置制备。在Glide 模块中进行筛选，导入制备好的受体，在受体网格生成中指定合适的位置，选取蛋白的原配体作为10Å 盒子的质心。将原配体再次对接，确认对接方法的可行性。经标准精度（Standard Precision Method，SP）对接后筛选，再利用额外精度（Extra Precision Method，XP）对接模板筛出SP 打分较高的前配体[4]。

2.2 虚拟筛选结果

2.2.1 结合模式及方法有效性分析EGR1 （4R2D）蛋白的晶体结构精度高，无关键残基缺失，通过阳性化合物进行多次测试，确定阳性化合物与活性位点的结 合 模 式。LYS-366、SER-378、HIS-382、ARG-379、ARG-357、GLU-354、PHE-349 等关键残基为稳定配体发挥着重要的作用，如：HIS-382 的五元环能与阳性化合物的苯环形成π-π 共轭，对蛋白口袋中小分子的稳定有较大贡献。为确定合适的对接方案，用于筛选潜在的活性化合物，我们将对接后的阳性化合物再次对接到EGR1 结合位点上。结合位点在化合物中的前后一致性，表明筛选有效，见图2。

图2 沙库巴曲缬沙坦与 EGR1 对接模式分析Fig. 2 The docking model and analysis of EGR1 with Sacubitril

2.2.2EGR1 配体及关键氨基酸筛选 根据SP 精度的筛选结果，再取分值小于−5.0 的化合物进行XP筛选，同时将6 种阳性化合物配体作为对照，分析阳性化合物与EGR1 作用模式，综合2 次筛选结果明确作用的关键氨基酸，见图3。再将阳性化合物与EGR1 进行柔性对接模式验证，选出打分较高且结合模式合理的化合物，并通过结合模式的对比分析，得出阳性化合物主要与LYS366、GLU354、ARG357、ARG379、SER378 等氨基酸残基形成氢键相互作用或共轭相互作用，这些化合物成为EGR1 配体的可能性大，见表1。

图3 阳性化合物与EGR1 作用模式Fig. 3 Modes of interaction between positive compounds and EGR1

表1 配体及氨基酸筛选结果Tab. 1 Ligand and amino acid screening results

2.2.3 Brazilin 的优先筛选 经SP、XP 筛选后，Brazilin 的结合能较低，为−9.30 kcal/mol，结合能越低代表化合物与蛋白结合能力越强，同时Brazilin 的结合位点包括THR385、SER378、HIS382、PHE377等氨基酸残基，与阳性化合物的接触位点较一致，见图4。由于Brazilin 含有较多相连的六元环，所以该化合物具有一定的刚性，但该化合物两端的苯环均能与蛋白的氨基酸（HIS382、PHE377）形成较好的π-π 共轭相互作用，有利于锚定分子在口袋中的“口袋因子”（具有稳定性的疏水性分子）；同时其六元环的羟基与多个氨基酸的活性基团均能够形成两个氢键（1.8Å），氢键距离较短，结合较强；此外，该化合物与蛋白的活性口袋还存在较强的疏水作用和范德华力。这些相互作用力对提高Brazilin 与EGR1 活性口袋的稳定性有重要作用，因此Brazilin 是本研究的优先筛选。

图4 Brazilin 与EGR1 靶蛋白的结合模式Fig. 4 The binding mode of Brazilin with EGR1 target protein

3 CHF 大鼠代谢组学的实验验证

3.1 实验材料

3.1.1 试药与仪器 Brazilin（批号：B20024），盐酸异丙肾上腺素（批号：S31064）均购自上海源叶生物科技有限公司；胎牛血清（批号：G8001，武汉赛维尔生物科技有限公司）；大鼠脑钠素(BNP)酶联免疫吸附测定试剂盒（批号：E-EL-R0126c，武汉伊莱瑞特生物科技有限公司）；2777C UPLC system 型液相色谱仪、Xevo G2-XS QTOF型质谱仪（美国Waters公司）；ECLIPSE Ci-L 型正置白光拍照显微镜（日本尼康公司）；扫描浏览软件CaseViewer2.4、Pannoramic DESK型全景切片扫描仪（匈牙利3DHISTECH 公司）；ZS3 Exp型小动物彩色多普勒超声诊断仪（中国迈瑞公司）。

3.1.2 动物 SPF 级SD 大鼠40 只，6 周龄，体质量为（200 ± 20）g，雄性［由西安交通大学医学部实验动物中心提供，许可证号：SCXK（陕）2018-001］。饲养条件按动物房常规条件设定，适应性饲养1 周后，称重、分笼及编号，进行实验。本研究经青海省中医院伦理委员会审批（编号：qhszyy1103201901）。

3.1.3 分组、造模及干预 按随机数字表法分组：空白组10 只、实验组30 只，均给予普通饲料分开饲养。实验组采用异丙肾上腺素诱导CHF 大鼠模型：予大鼠皮下多点连续注射（sc）10 mg/kg/d，连续注射14 d[7]，每日称量大鼠体质量，调整给药剂量。空白组注射等量生理盐水。造模结束后翌日对所有大鼠进行超声检测，检测前禁食水12 h，参考王晓燕[8]评价标准验证造模是否成功。剔除死亡及未成模的5只大鼠，从25 只成模大鼠中随机抽取10 只作为模型组，8 只作为Brazilin 组，空白组不变。

空白组和模型组灌服等量生理盐水。Brazilin 的制备及给药：称取0.5 g Brazilin，定容至100 mL，浓缩至临床等效剂量0.8 g/mL 贮存于4 ℃冰箱备用。给药的等效剂量根据大鼠与成人体表面积进行换算，对Brazilin 组进行（1 mL）0.4 g/100g 灌胃给药，1 次/d，连续6 周。给药期间观察并记录各组大鼠的一般情况。灌胃给药期间Brazilin 组大鼠死亡1 只。标本采集前12 h 开始禁食不禁水，最后用乌来糖麻醉大鼠，仰卧于手术台上腹主动脉采血，促凝管标本离心后取血清检测BNP 水平，抗凝管收集血液标本，2 ～ 3 mL/管并标号，将标本放置离心机离心，移液管取上层血浆，−80 ℃冰箱保存，用于代谢组学检测。

3.2 观察指标

3.2.1 血清BNP 检测 采用ELISA 法检测空白组及模型组大鼠脑钠肽（BNP），按动物模型评价标准对CHF 大鼠模型进行评价[7]。

3.2.2 HE 染色 心脏标本经生理盐水冲洗，置于4%多聚甲醛溶液中固定，按病理实验检测SOP 程序进行修剪、脱水、包埋、切片、染色、封片，最后镜检合格的样片，HE 染色观察心脏病理学形态改变。

3.2.3 心脏超声检查 在药物干预前对所有大鼠行心脏彩超检测，操作过程中履行盲法原则。彩超仪测量左心室射血分数（LVEF）、左心室收缩末期内径（LVESD）、左心室舒张末期内径（LEVDD），连续测3 个心动周期并取平均值，再按Teich 公式计算出左室短轴缩短率（LVFS）。

3.2.4 代谢组学 每份样品取40 μL 加入对应96孔板中；插入胎牛血清；加入甲醇120 µL 预冷，封膜后震荡摇匀1 min， 置于−20 ℃冰箱过夜；4℃，25 000 g 离心15 min；每份样品再取25 μL 置于新的96 孔板中，加入225 μL 50%甲醇进行稀释；每个样再次取50 μL 混合QC；取60 μL 上清液转到96 孔板中，封膜标识，并检测。

3.3 结果

3.3.1 血清BNP 水平 按大鼠BNP 试剂盒的ELISA 实验步骤，得出空白组与模型组血清BNP 值分别为（81.95 ± 6.31）和（405.56 ± 28.22）pg/mL，两者比较差异明显（P＜ 0.01），符合CHF 造模评价。

3.3.2 HE 染色结果 空白组大鼠心脏切片视野内组织染色均匀，心肌纤维形态结构正常、分界清晰、排列规则，间质未见明显异常，未见明显炎症，见图5A。模型组组织中可见较大量的心肌纤维水肿，胞质疏松淡染（黑色箭头，见图5B）；组织边缘多见心肌纤维溶解，被增生的结缔组织取代（黄色箭头，见图5B），伴有少量淋巴细胞浸润（红色箭头，见图5B）。

图5 大鼠心肌组织形态观察（ HE 染色，100×）Fig. 5 Morphological observation of myocardial tissue in rats（HE stain，100×）

3.3.3 心脏彩超结果 空白组与模型组LVEF 值分别 为（88.73 ± 2.08）% 和（52.54 ± 4.60）%，LVFS值分别为（65.01 ± 6.75）%和（36.76 ± 4.96）%，两者比较差异明显（P＜ 0.01），符合CHF 造模评价。

3.3.4 代谢组学分析结果 Meta X 软件获得组间的差异代谢物[9]，对其进行分类和功能注释。采用人类代谢组学数据库（HMDB）及KEGG 数据库的核心KEGG PATHWAY对差异代谢物进行分类和功能注释，明确差异代谢物的代谢途径及信号通路[10-11]。采用多变量的变量权重值（VIP），结合单变量分析差异倍数（FC）≥1.2 或≤0.833 3 和q-value ＜ 0.05，三者取交集得到差异代谢物[12]。

三组大鼠血浆的差异代谢物共209 个，主要分类有：氨基酸类、脂类、有机酸类、类固醇类、嘌呤类、醇类、萜类及黄酮类，见图6。最显著富集的通路是苯丙氨酸代谢、酪氨酸合成、2-氧代羧酸代谢，见图7。

图6 代谢物分类条形图Fig. 6 Bar chart of metabolite classification

图7 代谢通路富集分析气泡图Fig. 7 Bubble diagram of metabolic pathway enrichment analysis

4 讨论

2020 年版《中国药典》收载的豆科药用植物苏木，主要功效能行气化淤止痛，巴西苏木素（Brazilin）是其核心成分[13-14]。相关研究证实Brazilin具有抗炎、扩血管、延缓心室重构等药效活性。CLAUDIA C等[15]通过PBMC 基因表达谱认为EGR1 表达水平能区分缺血性和非缺血性扩张性CHF 患者，可作为CHF 的生物标志物。WU Y G[16]研究EGR1 的沉默表达能激活PI3K/Akt 通路，调节miR-26a/EGR1 轴，进而保护心血管系统。

按VIP 值大小排序，结合P值和FC值，并汇总可研究的代谢通路，选取最具典型的差异代谢物，主要涉及高同型半胱氨酸、高脱氧胆酸、槲皮素3-（6''-槐花苷）等。三组代谢组学的关键差异代谢物槲皮素3-（6''-槐花苷），属黄酮类，在模型组中显著下调，但在Brazilin 组中下调FC值较模型组低，表明Brazilin 干预有效，作用机制可能与铁螯合相关，Brazilin 能缓解蒽环类药物诱导的心肌损伤[17]。高同型半胱氨酸是模型组中上调最明显的差异代谢物，是氨基酸的异种；脂多糖（LPS）是CHF 的重要毒力因子，研究表明高同型半胱氨酸可介导LPS 发生促炎反应，主要机制是通过TLR4/NF-κB 炎症通路诱导心肌细胞肥大，使其糖脂代谢及结构排列紊乱[18]。而Brazilin组中高同型半胱氨酸较模型组明显降低，表明Brazilin 能抑制心血管炎症反应，可启动miR-27a-3p 产生心血管的保护作用[19]，延缓心室重构；高脱氧胆酸通过激活NF-κB 通路促进成熟炎症因子的表达，因而在模型组中表达明显上调，但Brazilin 干预后高脱氧胆酸的表达含量下调。结果表明Brazilin可调控血管内皮细胞的自噬平衡而发挥心室保护作用[20]，这可能与Brazilin 调控miR-27a-3p/EGR1 轴、TLR4/NF-κB 通路密切相关。

嘌呤碱途经2-氧代羧酸通路代谢最终生成尿酸，尿酸容易沉着在血管壁，损伤血管内皮细胞；糖脂过氧化反应会导致动脉狭窄，加重CHF 症状；络氨酸的代谢异常，会引发心肌血管内皮受损，而苯丙氨酸、络氨酸的合成又与TLR4/NF-κB通路相关[21-22]。

综上所述，Brazilin 对慢性心衰的治疗是通过多基因、多靶点、多通路的网络调控。Brazilin 可改善高脱氧胆酸、高同型半胱氨酸及槲皮素3-（6''-槐花苷）的代谢，成为治疗CHF 的可能，但其具体作用机制值得进一步深入研究。

5 结论

选取虚拟筛选中与EGR1 结合较好的Brazilin，经代谢组学实验证实可用于CHF 的治疗。但研究尚有不足，针对Brazilin 在慢性心衰的治疗作用机制阐述尚浅，后续将进行Brazilin 的体外酶活测定，并从分子水平探究Brazilin 的作用机制，有望为以Brazilin 为核心的药物开发提供研究基础。