陈 娟，周娟娟，秦亚东

（1.安徽中医药高等专科学校附属医院/芜湖市中医医院 制剂室，安徽 芜湖 241002；2. 安徽师范大学 生命科学学院，安徽 芜湖 241002；3. 安徽中医药高等专科学校 药学系，安徽 芜湖 241002）

五味子为木兰科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill. 的干燥成熟果实，主要分布在我国东北地区，又称北五味子。南五味子为木兰科植物华中五味子Schisandra sphenantheraRehd. et Wils. 的干燥成熟果实[1]，主要分布在我国山西、河南、安徽等地，又称华中五味子。历史上，南、北五味子作为不同来源的同一味药材收载和临床应用。自1995 年版《中国药典》起，南、北五味子作为两味药材进行收载，两味药材味酸、甘、温，归肺、心、肾经，均具收敛固涩、益气生津、补肾宁心之功。南、北五味子为同科同属植物，在外观性状、显微特征方面较为相似[2-3]，为鉴别带来了困难，加上野生北五味子价高量少，导致市场上时常有混用、掺入现象，因此，急需建立一种快速可靠的鉴别方法。

近年来，基于薄层色谱[4]、液相色谱[5-7]、红外光谱[8]、液质联用[9-11]等现代分析技术研究显示，以五味子醇甲、五味子酯甲等为代表的木脂素类化学成分在南、北五味子中存在着显著差异，可以作为识别标记物或质量标记物，从而达到二味药材鉴别的目的。课题组曾报道过南、北五味子液相色谱指纹图谱结合化学计量学手段对比分析研究，结果也表明五味子醇甲、五味子酯甲等为代表的木脂素类化学成分是南、北五味子主要差异性成分。2020 年版《中国药典》（一部）中明确规定了南、北五味子的定量指标分别为五味子醇甲和五味子酯甲，现代分析研究结果验证了《中国药典》定量指标设置的合理性。除上述方法外，基于药材颜色、气味、味觉、二维荧光光谱[12]和DNA 指纹图谱[13]等技术均可成功鉴别南、北五味子，然而这些方法往往试剂消耗大、分析时间长。

直接进样紫外（Flow-injection ultraviolet spectroscope,FI-UV）指纹图谱利用HPLC 技术，不经过色谱柱分离，只经过一根长度为5 mm 的保护柱（仅起到粗分和保护检测器功能）。相对于HPLC 指纹图谱，FI-UV 的突出优势是分析时间短（1 ～2 min/样），尤其适合大批量样品测试，目前国内未见文献报道。通过设置二极管阵列检测器（DAD）相关参数，以总紫外吸收、紫外光谱等为数据源绘制吸收曲线，可以直观地分析药材质量，达到可视化快速鉴别的目的；同时结合化学计量学手段，可以快速筛选关键变量[12-13]，避免主观判别造成的误差。FI-UV 与HPLC 指纹图谱相比优势十分明显，具有简单、快速的显著特点。本研究采用FI-UV 指纹图谱技术结合化学识别模式快速鉴别南、北五味子，为其分类鉴别提供了一种新方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1290 型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司）；FA1204 型精密电子天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）；JK-250DB 型超声波清洗仪（合肥金尼克超声波清洗机厂）；Minispin 型台式离心机（北京宏达恒业科技有限公司）。

1.2 试药

南、北五味子药材采购于安徽省亳州市康美中药材大市场及药店，北五味子为木兰科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.（SCB）的 干 燥 成熟果实，南五味子为木兰科植物华中五味子Schisandra sphenantheraRehd. et Wils.（SSW）的干燥成熟果实，均经安徽中医药高等专科学校附属医院/芜湖市中医医院中药材炮制中心祁俊主任中药师鉴定，样品信息见表1。药材粉碎后，过60 目筛，密封于EP 管中，置4 ℃冰箱中存储备用。乙腈、甲酸为色谱级（TEDIA，USA）、水为实验室自制超纯水、甲醇为分析纯。

表1 样品信息Tab. 1 Information of test sample

2 方法和结果

2.1 紫外指纹图谱条件

2.1.1 色谱条件 安捷伦保护柱：Agilent Zorbax SBC18柱（5 mm × 2.1 mm, 1.8 μm）；流动相：乙腈-水溶液（50 ∶50 / V ∶V），等度洗脱；流速：0.15 mL/min；进样量：1 μL；检测波长：254 nm。

2.1.2 检测器条件 设置DAD 检测器响应值：20 Hz，采集频率：0.05 s/次，扫描范围：190 ～400 nm，步进值：1 nm，进样量：1 μL。

2.2 供试品处理方法

样品粗粉过60 目筛，经恒温干燥至恒重后，精密称取五味子粉末 0.100 0 g,置15 mL 具塞离心管中，加入50%甲醇-水（V ∶V）溶液10 mL，超声1 h 后离心处理（3 000 r/min）15 min，上层溶液过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液，备用。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 以SCB1 样品为考察对象，按“2.2”项下方法制备供试品1 份，按“2.1”项下条件连续进样6 次，数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）”，经多点校正、自动匹配，结果相似度均大于0.982，说明仪器精密度良好。

2.3.2 稳定性试验 以SCB1 样品为考察对象，按“2.2”项下方法条件制备供试品6 份，按“2.1”项下条件分别于0、2、4、8、12 h 进样，数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）”，结果相似度均大于0.965，说明样品在12 h 内稳定。

2.3.3 重复性试验 以SCB1 样品为考察对象，按“2.2”项下方法条件，制备供试品溶液6 份，按“2.1”项下条件分别进样，数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）”，结果相似度均大于0.977，说明该方法重复性良好。

2.4 直接进样紫外指纹图谱

2.4.1 总紫外吸收指纹图谱 所有供试液经液相色谱仪自动进样1 μL，通过C18保护柱，不经色谱柱分离直接进入DAD 检测器，按“2.1”项进行参数设置，每个样品平行进样 3 次。11 批 SCB 样品和11 批 SSW 样品的FI-UV 指纹图谱，见图1。直观分析可见，SCB 和SSW 样品的总吸收指纹图谱轮廓明显不同，其中，SCB 样品（图1A）在保留时间约0.13 min 处的吸收明显小于SSW 样品（图1B）；在保留时间约0.25 min 处，SCB 样品的吸收明显高于SSW 样品，SSW 样品保留时间约0.25 min 处几乎无吸收；除此之外，在保留时间约0.49、0.61 和0.89 min 处，SCB 和SSW 样品吸收呈现明显不同。

图1 北五味子（A）和南五味子（B）总紫外吸收指纹图谱（n = 33）Fig. 1 Total absorbance chromatograms of SCB（A） and SSW（B）（n = 33）

2.4.2 紫外光谱指纹图谱 充分利用DAD 检测器性能和挖掘“海量”数据内在隐藏信息，使得到的紫外光谱指纹图谱更加稳定可靠。对比SCB 和SSW 样品总流出曲线图，直观可见，在保留时间为0.13 min（色谱峰1）和0.25 min（色谱峰2）处，SCB 和SSW明显不同。因此，对保留时间为0.13 min 和0.25 min处产生的“色谱峰”顶点处的平均紫外扫描光谱（190 ～400 nm）数据进行提取、导出、合并，结果如图2 所示。直观分析可见，保留时间约0.13 min处色谱峰的平均紫外光谱（图2A、图2B）较为相似；保留时间约0.25 min 处色谱峰的紫外光谱轮廓呈现不同特点（图2C、图2D），在211、253 nm 附近SSW 样品出现2 个明显的吸收峰，明显强于SCB样品在211、253 nm 产生的吸收，且SSW 样品在保留时间约0.25 min 处色谱峰的紫外光谱强度整体上明显强于SCB 样品。

图2 北五味子和南五味子紫外光谱指纹图谱Fig. 2 Ultraviolet spectra for SCB and SSW

2.5 多元统计分析

2.5.1 PCA 分析 为更加客观地分析南、北五味子FI-UV 的差异性，将总紫外吸收指纹图谱（0 ～2 min）数据导出、合并，以响应值为变量，经Log 转换和UV Scaling 处理后，每个样本总紫外吸收有2 401 个数据采集点、第一“色谱峰”和第二“色谱峰”顶点处紫外光谱有211 个数据采集点。分别对由 2 401 ×125 形成的数据矩阵和211 × 125 形成的数据矩阵，共66（22 × 3）个样本进行无监督主成分分析（PCA），结果见图3。以总流出曲线进行PCA 分析，SCB 和SSW 两组样品可获得良好的分类（图3A），所有SCB 样品均分布在t[1]象限正值区域，所有SSW 样品均分布在t[1]象限负值区域；以第一“色谱峰”顶点处紫外光谱进行PCA 分析，同样获得良好的区分效果（图3B）；以第二“色谱峰”顶点处紫外光谱进行PCA 分析，分类效果不理想（图3C）。

图3 北五味子与南五味子样品PCA 得分图Fig. 3 Principal component analysis score of SCB and SSW sample

2.5.2 PLS-DA 分析 在第一色谱峰顶点光谱指纹图谱无监督PCA 分类信息的基础上，为继续缩小组内差异，使组间差异最大化，以光谱指纹图谱 190 ～400 nm 的211 个数据点的响应值为变量，对66（22 ×3）个样本进行偏最小二乘回归分析（PLS-DA）。3

南、北五味子所处象限范围与PCA 分析相一致，组内差异变小，组间差异扩大，见图4。由图4 可知，SCB 样品分布在t[1]负值区域，SSW 分布在t[1]正值区域，南、北五味子样品可以达到较好的区分效果。PLS-DA 分析与PCA 分析虽然结果类似，但与PCA 分析结果相比，组内的分布更为集中。PLS-DA作为有监督的分类模式，通过缩小组内差异和组间差异的最大化，该模型R2X= 0.993，R2Y= 0.988，Q2=0.988，表明该模型稳定性好，预测能力强。

图4 北五味子与南五味子样品PLS-DA 得分图Fig. 4 PLS-DA score of SCB and SSW sample

211、240、253、287 nm 对SCB 和SSW 的区分起到主要作用，结合变量的VIP 值大于1 的原则，211、240、253 nm 对南、北五味子的分类起到关键作用，说明这3 个波长对应的响应值对3 个属的五味子区分起到重要作用；考虑到211 nm 靠近紫外末端吸收，可能存在非小分子有机化合物产生信号，如多糖的特征吸收在190 nm 附近，信号的波动较大，见图5。因此，综合考虑240、353 nm 对区分SCB 和SSW 样品起到决定作用。分别以211、240、253 nm；240、253 nm 变量为数据源进行PCA 分析，结果见图6。

图5 北五味子与南五味子样品平均紫外光谱和变量系数图Fig. 5 Averaged UV spectra and variable coefficient of SCB and SSW sample

图6 北五味子与南五味子样品在不同波长紫外吸收PCA 得分图Fig. 6 SCB and SSW sample's PCA score of UV spectra absorption in different wavelength

由图6 可知，SCB 和SSW 样品区分效果较好。SCB 样品分布在t[1]象限负值区域，远离SSW 样品；SSW 样品分布在t[1]象限正值区域。说明变量211、240 和253 nm 对SCB 和SSW 样品的分类起到重要作用，尤其是240、253 nm 变量对它们的分类起到决定作用。

3 讨论

不同产地、采收季节、种属、炮制工艺等来源的中药，其内在质量通常存在差异性。在中药鉴别方面，液相色谱指纹图谱能够全面地反映样品的信息，给出更多化学成分信息，但传统液相色谱指纹图谱在中药鉴别领域往往需要更多的分析时间、消耗更多的试剂。FI-UV 指纹图谱虽不能提供具体化合物的相关信息，但能从整体对南、北五味子进行快速鉴别，同时FI-UV 最显著优势在于分析时间短，每个样品仅需要1 ～2 min，尤其适合大量样品测试；且利用液相色谱仪的性能，使得紫外光谱具有较高的稳定性；样品前处理简单，节约试剂。

紫外光谱指纹图谱在中药质量评价、产地鉴别等领域已有学者进行有益探索[7]，但未进行深入挖掘。由于采样较为困难，本研究仅对收集到的11 份北五味子和11 份南五味子药材进行FI-UV 测试，其总紫外吸收图谱和紫外光谱图轮廓明显不同。进一步利用化学统计学手段，充分挖掘大量变量隐藏信息，PCA、PLS-DA 分析结果并结合变量VIP 值及紫外吸收特征显示：对北五味子和南五味子药材分类起重要作用的变量为211、240 和253 nm，考虑到211 nm接近紫外的末端吸收，干扰比较多，进一步以240 和253 nm 为变量进行无监督PCA 分析，依然能够取得理想的鉴别效果。FI-UV 从整体角度反映了北五味子与南五味子药材的化学成分存在明显的差异，为五味子类药材及其它中药资源的快速鉴别及内在质量控制提供参考和借鉴。

4 结论

本研究建立的南、北五味子FI-UV 指纹图谱方法，能够快速准确鉴别南、北五味子，从整体层面反映两种来源五味子的差异性，同时结合化学计量学方法能够避免传统性状鉴别的主观性。该方法分析速度快、稳定性和重复性良好、操作简便易行，为不同来源的五味子类药材的鉴别提供了新的参考方法，对药材科学鉴别起到促进作用。