张 山，秦欣欣，于会勇，王成祥

（北京中医药大学第三附属医院 呼吸科，北京 100029）

慢性阻塞性肺疾病（Chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是以持续性呼吸道症状和气流受限为特征的常见疾病[1]。COPD 常因感染等因素而诱发加重，且常合并肺外疾病[2]，使得病情复杂反复，因此慢性阻塞性肺疾病全球倡议（GOLD）[1]强调加强COPD 稳定期的管理，减少未来急性加重的风险，是COPD 治疗的长期目标。目前该病的发病机制尚未完全阐明，其中炎症-免疫反应、蛋白酶-抗蛋白酶失衡、氧化应激损伤等是公认的参与COPD 发病的重要机制[3]。COPD 的药物疗法多以支气管扩张剂、吸入用糖皮质激素、抗菌药物等对症治疗为主[4]，存在疗效不佳、副作用大等弊端[5]，中医药治疗COPD则有显著的优势，因此迫切需要寻求针对COPD 更加有效的治疗方药。

都气丸出自明代秦景明所著《症因脉治》，由六味地黄丸合五味子组成，是治疗肾虚喘嗽的名方。近年来，多项临床研究表明都气丸能够有效改善COPD 患者临床症状及肺功能，减少急性加重发作次数，提高患者生活质量[6-8]，发挥“既病防变”的作用，是治疗COPD 的有效方剂。基础实验已证实都气丸具有抑制或减轻细胞抗氧化过程，增强机体的免疫作用[9-10]。然而该复方治疗COPD 的潜在靶点和作用机制鲜见报道，本研究基于网络药理学的系统性、整体性特点，突破传统分子生物学单靶点研究模式的束缚，与中医整体观、辨证论治思想更为契合[11]，通过构建多成分-多靶点的复杂网状关系及分子对接，预测都气丸治疗COPD 的分子作用机制，为实验研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 都气丸成分及靶点的筛选

依据中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP,https://tcmspw.com/tcmsp.php） 获 取 都 气 丸 中 熟地、山药、山茱萸、茯苓、泽泻、牡丹皮、五味子的所有活性成分，设定口服生物利用度（Oral bioavailability, OB）≥30%且类药性（Drug-likeness,DL）≥0.18，初步筛选都气丸的活性化合物及其作用靶点，并运用Uniprot 数据库（https://www.uniprot.org/）将药物靶点转化为标准化基因名称。

1.2 都气丸活性成分-靶点网络构建

运用CytoScape 3.7.1 软件构建都气丸活性成分-靶点网络，进行可视化展示。并利用其内置插件CytoNCA 分析活性成分及网络拓扑学参数，包括点度中心性（Degree centrality, DC）、中介中心性（Betweenness centrality, BC）及接近中心性（Closeness centrality, CC），参数值越大，说明节点越接近网络的中心[12]，从而判断都气丸的主要活性成分。

1.3 COPD 相关靶点的筛选

利用Pubmed 平台获得“慢性阻塞性肺疾病”病名主题词“Pulmonary Disease, Chronic Obstructive”为关键词，挖掘GeneCards 数据库（https://www.genecards.org/）、OMIM 数据库（https://omim.org/）、TTD 数 据 库（http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）、DRUGBANK 数据库（https://www.drugbank.ca/）中COPD 的潜在靶点，并根据数据库靶点的相关系数对COPD 相关靶点进行筛选，将得到的靶点汇总并去除重复值，得到COPD 相关疾病靶点。

1.4 都气丸活性成分-COPD靶点蛋白互作网络的构建

运用线上作图工具Draw Venn Diagram 将都气丸活性分子靶点与COPD 疾病靶点做映射取交集，绘制韦恩图，得到都气丸与COPD 的共同靶点基因。进而将共同靶点基因导入STRING 11.0 平台（https://string-db.org/），物种设定为“Homo sapiens”，参数采用默认设置，构建蛋白互作（PPI）网络[13]模型，并下载“.tsv”文件，导入CytoScape 3.7.1 软件进行可视化，同样利用内置插件CytoNCA 分析相关网络拓扑学参数，得出核心蛋白靶点。

1.5 GO 及KEGG 富集分析

通过Bioconductor 下载clusterProfiler 程序包，运用R 软件对都气丸活性成分及COPD 的共同靶点进行GO（Gene ontology）分析及KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）信号通路富集分析，GO 富集分析包括生物过程（Biological process，BP）、分子功能（Molecular function，MF）和细胞组成（Cellular component，CC）三个模块。设定P＜0.05，并根据基因靶点数目，选择BP/MF/CC 的前10 个条目以及KEGG 的前20 个信号通路，绘制气泡图。

1.6 活性成分-靶点分子对接

借助PubChem平台下载都气丸活性成分的“SDF”格式文件，运用Open Babel GUI 软件将其转化为“mol2”格式，导入PyRx 软件进行能量最小化处理，随后导入Auto Dock Tools 1.5.6 软件转化为“PDBQT”格式，作为对接配体。将“1.4”筛选出的排名前5 的主要蛋白靶点，从PDB 数据库（https://www.rcsb.org/）中查找其PDB ID，并下载其三维蛋白结构（PDB 格式），采用PyMol 软件去水，去除小分子及配体，并导入AutoDock Tools 1.5.6 软件，加氢，计算电荷，添加原子类型，导出为“PDBQT”格式文件。运行 AutoDock Vina 1.1.2 软件[14]进行对接，采用PyMol 软件处理可视化对接结果。

2 结果

2.1 都气丸活性成分的靶点获取

结合TCMSP 数据库，经OB 及DL 筛选后获得都气丸活性成分，其中，熟地2 种，山药16 种，山茱萸20 种，茯苓15 种，泽泻10 种，牡丹皮11 种，五味子8 种。剔除无相关靶点的成分27 种，合并重复成分5 种，得到都气丸活性成分50 种，见表1。同时筛选获得489 个药物靶点，合并后删除重复值共得到靶点203 个。

表1 都气丸主要活性成分Tab. 1 The main active ingredient of Duqi pill

2.2 都气丸活性成分-靶点网络

将都气丸的50 种活性成分以及203 个药物靶点导入CytoScape 3.7.1 软件，构建活性成分-靶点网络，共获得260 个节点，544 条边，见图1。其中每个节点代表化合物分子或作用靶点，节点与节点之间的边代表生物分子间的相互作用，图中可见节点越大，相互作用的Degree 值越高，且一个活性分子可作用于多个靶点，多个活性分子可作用于一个靶点，体现了都气丸多成分、多靶点协同作用的特点。利用CytoNCA 插件计算网络拓扑学参数，结果表明槲皮素DC 为145，BC 为43 138.527，CC 为0.560 606 06，均为所有活性分子中的最高值，预测槲皮素为都气丸的主要活性成分。其次为山柰酚（DC 为58，BC为8 994.256，CC 为0.411 111）、β-谷甾醇（DC 为36，BC 为5 805.335，CC 为0.382 006）、豆甾醇（DC为31，BC 为6 336.957，CC 为0.379 765）、海风藤酮（DC 为27，BC 为2 998.726，CC 为0.371 06），前10 位核心化合物见表2。

图1 都气丸活性成分-靶点网络图Fig. 1 Active component-target network diagram of Duqi pill

表2 前10 位主要活性分子网络节点特征参数Tab. 2 Characteristic parameters of the top 10 main active molecular network nodes

2.3 COPD 相关靶点的获取

从GeneCards、OMIM、TTD、DRUGBANK 数据库检索“Pulmonary Disease, Chronic Obstructive”，其中在GeneCards 数据库中共获得6 060 个COPD 相关靶点，Relevance score 值越高则代表该靶点与疾病联系越密切，节选Score ＞30 的靶点为COPD 的潜在靶点478 个。将以上4 个数据库疾病靶点合并后删除重复值，最终得到1 053 个COPD 相关靶点。

2.4 都气丸活性成分-COPD 靶点PPI 网络的构建

对筛选的都气丸203 个活性成分靶点与COPD的1 053 个疾病靶点取交集，绘制韦恩图，得到都气丸成分-COPD 共同靶点91 个，见图2。将靶点提交至STRING 11.0 平台，下载“.tsv”文件，导入CytoScape 3.7.1 软件，得到都气丸活性成分-COPD靶点PPI 网络，见图3。同样利用CytoNCA 插件计算网络拓扑学参数，结果表明IL-6、AKT1、TNF、VEGFA、MMP9 等拓扑学参数值DC、BC、CC 最高，可作为都气丸治疗COPD 的潜在靶点，节选网络拓扑学参数排名前10 位的靶点，见表3。

图2 药物与疾病靶点韦恩图Fig. 2 Venn diagram of drug and disease targets

图3 活性成分-疾病靶点PPI 网络图Fig. 3 Active ingredient - disease target PPI network diagram

表3 前10 位主要蛋白靶点网络节点特征参数Tab. 3 Characteristic parameters of the top 10 protein target network nodes

2.5 GO 及KEGG 富集分析

使用 R 软件对活性分子与疾病的91 个共同靶点进行GO 及KEGG 富集分析，气泡颜色由红到蓝表示P值由小到大，P值越小显著性越强，气泡越大代表该通路的基因计数count 值越大，横轴代表该功能富集基因占总体输入基因的比率。

GO 富集结果共富集2 332 条 GO 功能条目（P＜0.05），其中富集最显著的 BP、CC、MF 前 10 名结果见图4。提示都气丸活性成分可能通过以上生物学反应在治疗COPD 过程中发挥作用。

图4 GO 分析气泡图Fig. 4 GO analyzes bubble graphs

KEGG 富集结果显示共富集到151 条信号通路，其中排名前20 的富集通路见图5。靶点通路富集结果（前20 位），见表4。

图5 KEGG 分析气泡图Fig. 5 KEGG analyzes bubble graphs

表4 都气丸治疗COPD 靶点通路富集结果（前20 位）Tab. 4 Enrichment results of Duqi pill in treatment of COPD target pathway（top 20）

2.6 分子对接验证

将“2.2”中得到的都气丸的前4 个关键活性成分与“2.4”中得到的前5 位核心蛋白靶点进行分子对接，受体蛋白（IL-6、AKT1、TNF、VEGFA、MMP9）相对应的PDB ID 分别为1ALU、1UNQ、5UUI、3QTK、6ESM。配体与受体结合时能量越低，构象越稳定，两者发生作用的可能性越大。结合能小于0 说明配体与受体可自发结合，本研究选取结合能≤-5.0 kJ/mol 作为筛选标准[15]。分子对接结果见表5，可以看出都气丸关键活性成分与核心蛋白靶点之间均具有较好的结合活性，其中，槲皮素、山柰酚与5 个核心靶点的结合能均明显低于β-谷甾醇、豆甾醇、海风藤酮，表明槲皮素、山柰酚与受体蛋白形成构象能量更低。选取槲皮素与山柰酚部分活性成分对接模式见图6，均有氢键作用，说明关键分子与靶点蛋白作用结构较为稳定，结合活性较高。

图6 都气丸关键活性化合物与核心蛋白靶点分子对接模式Fig. 6 Docking mode between key active compounds and core protein target molecules of Duqi pill

表5 关键活性成分与核心蛋白靶点分子对接的结合能Tab. 5 Binding energy of key active ingredients and core protein target molecules

3 讨论

本研究首先采用TCMSP 平台筛选，共获得都气丸活性成分50 种，进一步通过网络拓扑学分析得出都气丸治疗COPD 的关键活性分子为槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、豆甾醇、海风藤酮等。其中，槲皮素、山柰酚为植物黄酮类化合物，β-谷甾醇、豆甾醇为植物甾醇类化合物，均具有明确的抗氧化、抗炎、抗肿瘤等药理特性[16-19]。COPD 相关基础研究表明，槲皮素可通过降低经弹性蛋白酶/脂多糖处理的COPD 小鼠体内的氧化应激水平，抑制促炎细胞因子表达以及基质金属蛋白酶MMP9、MMP12 的表达，改善肺弹性、减轻肺部炎症以及杯状细胞上皮化生，从而阻止肺气肿的进展[20]，同样可以减弱鼻病毒诱导的COPD 表型小鼠的肺部疾病进展[21]，并且具有松弛支气管平滑肌的作用[22]，有望成为治疗COPD的新型治疗药物[23]。山柰酚可通过调节促炎相关通路NF-κB 的激活[24]，以及LPS 刺激的J774.2 巨噬细胞中IL-1 和TNF -α 合成[25]，发挥重要的抗炎作用。分子对接验证结果亦证实槲皮素和山柰酚两者与COPD 核心蛋白靶点作用结构更稳定，具有较高的结合活性。β-谷甾醇、谷甾醇的抗炎机制可通过降低NO的合成, 抑制巨噬细胞分泌炎性因子来实现[26-27]，且β-谷甾醇具有较强的抑菌活性，能够抑制枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等细菌的生长[28]。海风藤酮亦具有抗氧化活性[29]，然而尚无与COPD 相关的报道，这就为COPD 相关治疗药物的研究提供一定借鉴。

PPI 网络图显示，都气丸治疗COPD 的潜在靶点有多个，靶点之间也具有复杂的相互作用关系，体现了中药复方治疗COPD 多靶点、多突破点、多成分的特征。进一步根据网络拓扑学参数结果，证明IL-6、AKT1、TNF、VEGFA、MMP9 是主要靶标。IL-6 主要是由单核巨噬细胞和T 细胞产生的全身性促炎细胞因子，参与COPD 急性加重过程，是反映COPD 严重程度与预后的重要生物标记物[30]；同时IL-6 在稳定期患者中也高表达[31]，长期IL-6 参与的炎症刺激导致气道阻塞、气道及血管重塑，进一步继发肺气肿和肺动脉高压的形成[32]。AKT1 是一类进化上高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶最具特征的家族成员之一，与细胞存活、凋亡、炎症等过程密切相关，其上游负性调节基因PTEN 的突变可导致AKT的持续激活，使得COPD 患者即使戒烟后仍存在持续性炎症状态[33]，同时AKT 也参与COPD 患者的骨骼肌萎缩机制，加速骨骼肌肌纤维蛋白的消耗[34]。TNF 尤其TNF-α 是在COPD 疾病中研究最多的细胞因子之一，TNF-α 是较为公认的COPD 易感基因[35]，可激活巨噬细胞，增加细胞毒性，同时也能刺激IL-6 分泌，诱导炎症细胞的积累，进一步引起氧化应激、组织重构等，促进COPD 的发生发展[36]。MMP-9 是基质金属蛋白酶（MMPs）家族中分子量最大的多功能酶，由中性粒细胞合成，是评估COPD的重要标志物[37]。MMP-9 可破坏肺实质中细胞外基质成分，亦可激活和释放生长因子如血管内皮生长因子A（VEGFA），诱导肺部血管新生与血管重塑[38]，是COPD 并发肺癌的重要机制之一[39]。 以上5 个潜在靶点与COPD 的发病机制密切相关，并且与GO分析生物学功能富集程度较高的对脂多糖的反应、对细菌来源分子的反应、活性氧代谢过程、抗氧化反应、细胞因子的活性等存在一致性，因此可作为都气丸治疗COPD 的核心靶点，指导下一步的实验验证。

结合KEGG 通路富集及文献分析，富集程度最高的通路中，涉及病毒在内的病原体感染以及炎症相关的通路最多，与COPD 急性加重机制或炎症发病机制类似。其中，肿瘤坏死因子TNF、细胞因子IL-17 信号通路均可介导NF-κB、MAPKs 信号通路发挥抗炎作用[40-41]；COPD 缺氧状态下，引发肺组织细胞缺氧诱导因子-1（HIF-1）信号通路的激活，进而增加VEGF 的表达，在COPD 血管生成和气道重构中发挥重要作用[42]。

4 结论

基于网络药理学和分子对接技术，都气丸治疗COPD 的活性分子主要为槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、豆甾醇等，并与核心靶点IL-6、AKT1、TNF、VEGFA、MMP9 有较好的对接活性，作用于多条感染及炎症相关通路，体现了都气丸治疗COPD 的多成分、多靶点、多通路联合作用的特点，这将为后续进一步开展相关基础实验研究提供理论依据。