何淑娴 ，文华枢 ，谢德春 ，李友余 ，李超荣 ，刘志发 ，张朝明，吴天民，宋 斌，莫美华

（1．华南农业大学食品学院，广东 广州 510642；2．广东省科学院微生物研究所，华南应用微生物国家重点实验室，广东省菌种保藏与应用重点实验室，广东 广州 510070；3．南华大学公共卫生学院，湖南 衡阳 421001；4．广东云开山省级自然保护区管理处，广东 信宜 525343；5．广东南岭国家级自然保护区管理局，广东 乳源 521727）

粉褶蕈属（Entoloma）是大型真菌中的世界广泛分布属，在分类学上隶属于真菌界（Fungi）担子菌门 （Basidiomycota） 伞菌纲 （Agaricomycetes） 伞菌目（Agaricales） 粉褶蕈科 （Entolomataceae）。该属种类繁多，分布广泛，全世界已报道的约1 800种，某些种已知具有食用和药用或有毒的经济价值[1-3]。中国地域辽阔，地形复杂，气候各异，南北温差大，具有丰富的真菌物种多样性，已报道的粉褶蕈属种类超过100个，包括一些新种[4-19]。

通过对广东云开山国家级自然保护区及广东南岭国家级自然保护区进行大型真菌资源调查，发现一中国新记录种——比杜普粉褶蕈（Entoloma bidupense），现描述报道如下。

1 材料与方法

1.1 供试标本

标本GDGM 76710和GDGM 76742采自广东云开山国家级自然保护区，GDGM 86876采自广东南岭国家级自然保护区。野外采集时首先对新鲜的子实体及生境进行拍摄，然后将子实体放入采集袋中带回驻地；取一小块干净的子实体组织放入装有吸水硅胶中作为分子材料备用，记录其子实体的宏观形态特征和生境信息；余下放入烘箱50℃烘干至恒重，干燥后的标本用自封袋保存。研究标本保藏于广东省科学院微生物研究所真菌标本馆（The Fungal Herbarium of Guangdong Institute of Microbiology,Guangdong Academy of Sciences，GDGM）。

1.2 主要试剂和设备

主要试剂：硅胶，广州化学试剂厂；真菌DNA小量提取试剂盒，广州美基生物科技有限公司；PCR扩增试剂，北京全式金科技有限公司。

主要设备：水浴锅，托普仪器有限公司；研磨仪，上海净信实业发展有限公司；离心机，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；Olympus BX51光学显微镜，日本奥林巴斯公司。

1.3 形态学研究

依据对新鲜标本和野外拍摄照片及其观察记录（包括菌盖、菌肉、菌褶、菌柄等的形态、大小和颜色）进行形态学特征描述。颜色描述依据参考文献[20]进行。显微结构观察描述是对烘干标本进行观察、拍照和记录：使用双面刀片切取目标组织块，用5%的KOH溶液复水、1%刚果红和碘试剂进行显微制片，观察、测量、记录担孢子、担子、囊状体、菌盖皮层及菌丝结构等的显微结构特征。具体参照何晓兰等和李传华等的方法[4，9，12]。

1.4 分子系统学研究

用Magen真菌DNA小量提取试剂盒提取子实体DNA；采用真核生物通用引物 ITS1/ITS4（ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′； ITS4:5′-TCCTC CGCTTATTGATATGC-3′） 进行PCR扩增。反应体系为 12.5 μL PCR Mix，上下游引物各 1 μL，DNA模板 1 μL，加ddH2O至 25 μL。反应程序为：95℃预变性 5 min；95℃变性30 s，52℃退火 30 s，72℃延伸1 min，35个循环；最后72℃延伸10 min；4℃保温[14]。扩增产物经1%琼脂凝胶电泳检测后，送深圳华大基因科技服务有限公司进行双向测序。核对获得的ITS序列峰图，确认碱基的准确性，并对序列进行双向拼接。将拼接的序列在GeneBank数据库中进行Blast比对，选择同源性较高的相关序列，结果见表1。

表1 系统发育树构建所用标本信息Tab.1 Specimens information used for phylogenetic tree construction

选择表1中的序列，采用PhyloSuite vl.2.2软件基于最大似然法（Maximum Likelihood，ML） 构建系统发育树[21]，选取耳状斜盖伞（Clitopilus hirneolus）作为系统发育树的外类群[22]。

2 结果与分析

2.1 基本信息

标本GDGM 76710：采集时间2019-07-23；采集地广东省信宜市云开山国家级自然保护区大田顶天池 （22°13′59″N～22°21′23″N，111°08′19″E～111°23′45″E，海拔1 200 m）；采集人宋斌、李骥鹏、文华枢。

标本GDGM 76742：采集时间2019-07-23；采集地广东省信宜市云开山国家级自然保护区大田顶天池 （22°13′59″N～22°21′23″N，111°08′19″E～111°23′45″E，海拔1 200 m）；采集人宋斌、李骥鹏、文华枢。

标本GDGM 86876：采集时间2021-07-31；采集地广东南岭国家级自然保护区称架滑冲坑（24°76′63.2″N，113°05′91.3″E，海拔 150 m）；采集人宋斌、何淑娴、谢德春、钟国瑞。

世界分布：中国、越南[22]。由调查得知，样品菌类夏秋季单生或散生于常绿混交林的土壤上。

2.2 形态特征描述

比杜普粉褶蕈（Entoloma bidupense O.V.Morozova&E.S.Popov） 新鲜子实体形态特征见图1。

图1 比杜普粉褶蕈子实体Fig.1 Fruit body of Entoloma bidupense

如图1所示，子实体中等大小，近杯伞状至口蘑状，深蓝色至渐变棕蓝色；菌盖直径约1.5 cm～4.5 cm，初期半球形，边缘弯曲，然后凸出到平凸，中心略微凹陷，至稍平展，成熟时或撕裂，表面密布微小鳞片，深蓝色至成熟时渐变灰棕色，盖缘鳞片颜色变浅；菌肉近米白色至浅灰白色；菌褶直生，稍微缺失至微齿状，白色至米粉红色，具流苏状浅蓝色边缘；菌柄（40～70） mm×（4～6） mm，中生，圆柱形至近圆柱形，等粗或向下稍渐粗，或具纵向沟纹，与菌盖同色或颜色稍浅，顶端稍白，纤维状至鳞片状，基部被白色绒毛；未见菌环；子实体气味和味道不明显。

比杜普粉褶蕈的孢子菌盖、菌褶等显微观察结果见图2。

图2 比杜普粉褶蕈的显微特征Fig.2 Microscopic characteristics of Entoloma bidupense

如图 2所示，担孢子 （9.3～12.0） μm×（5.8～8.4） μm，孢子的长宽比Q=1.2～1.7（异径），具有5角或6角，侧面角度稍为明显；担子（35.7～46.5）μm×（8.4～11.3） μm，窄棍棒状至近圆柱形，具4个担子小梗，具锁状联合；不育担子近圆柱形，褶缘异质；褶缘囊状体 （35.8～117） μm × （6.6～13.8）μm，圆柱形、棍棒状至宽烧瓶状，末端具蓝色色素或无；侧生囊状体未见；菌盖皮层近毛皮状，末端菌丝圆柱形，直径12 μm～17 μm，具锁状联合。

2.3 系统发育分析

经Blast比对分析，研究标本GDGM 76710、GDGM 76742、GDGM 86876与E.bidupense模式标本的ITS序列相似度分别达99.38%、99.01%、99.48%。通过文献查阅，研究标本GDGM 76710、GDGM 76742、GDGM 86876和E.bidupense模式标本的ITS序列，以及其他粉褶蕈属物种的ITS序列，以Clitopilus hirneolus为外类群，采用最大似然法构建系统发育树，结果见图3。

图3 基于最大似然法构建的ITS序列系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of ITS sequences based on Maximum Likelihood method

如图3所示，3个研究标本与E.bidupense聚为一个分支，自展支持率（bootstrap value，BS） 为100%，确认为同一个物种。

3 结论与讨论

经形态特征比较和分子系统发育树分析，3份标本鉴定结果应为比杜普粉褶蕈E.bidupense，经查证为中国新记录种。

研究标本与产地为越南的比杜普粉褶蕈模式标本的形态特征基本相同[22]。生境方面，研究标本采集于海拔150 m～1 200 m的常绿混交林的土壤及道路边树林的土壤，而比杜普粉褶蕈的模式标本采集于越南中部比杜普努巴国家公园附近的海拔约1 600 m的常绿混交林下土壤。比杜普粉褶蕈E.bidupense在形态上与布拉赫粉褶蕈（E.bulakhae） 非常相似，区别在于比杜普粉褶蕈E.bidupense菌盖深蓝色至灰棕色，菌盖稍凹陷，非脐状，菌褶直生，E.bidupense菌盖紫罗兰色至灰紫罗兰色，菌盖中央明显凹陷，脐状，菌褶延生。比杜普粉褶蕈E.bidupensee在系统发育关系上与紫纹粉褶蕈（E.vio-laceozonatum）关系密切，在形态上比较相似，皆具流苏状菌褶边缘和具锁状联合的担子；但比杜普粉褶蕈E.bidupense菌盖稍凹陷，非脐状，菌柄鳞片纤毛状、小鳞片状，而紫纹粉褶蕈E.violaceozonatum菌盖中央明显凹陷，脐状，菌柄鳞片细条纹状；并且两者在地理分布上也有足够的差异，比杜普粉褶蕈E.bidupense模式产地为越南，紫纹粉褶蕈E.violaceozona-tum仅见于欧洲[22,25]。此外，比杜普粉褶蕈E.bidupense在形态上与报道于广东的蓝鳞粉褶蕈（E.azureosquamulosum） 也比较相似[11]，区别在于比杜普粉褶蕈E.bidupense菌盖深蓝色至灰棕色，褶缘囊状体棍棒状至宽烧瓶状，而蓝鳞粉褶蕈E.azureosquamulosum菌盖颜色为带紫色色调的深蓝色，密被鳞片，褶缘囊状体梭形至纺锤形，且在系统发育树上，两者系统发育位置具有明显的区别。

粉褶蕈属真菌广布于世界各地，是温带和热带地区真菌区系的重要组成部分[4]。广东云开山国家级保护区地处热带和亚热带过渡区域，广东省南岭国家自然保护区属中亚热带湿润型季风气候，2个国家级保护区均是中国南方地区高等真菌资源分布及生物多样性研究的重要地域[26-28]。比杜普粉褶蕈E.bidupense作为中国新记录种首次在2个保护区的发现，补充了我国粉褶蕈物种的种类及分布区域，为粉褶蕈属的物种多样性和潜在的经济应用价值积累了科学资料。