林 旭，丁李春，李志刚

（宁德市农业科学研究所，福建 福安 355017）

暗褐网柄牛肝菌（Phlebopus portentosus），隶属小牛肝菌科（Boletinellaceae） 脉柄牛肝菌属（Phlebopus）[1]。该品种主要分布在我国云南省，被当地人俗称为“黑牛肝菌”[2]。其子实体营养丰富，富含蛋白质、多种氨基酸及钾、钙、铁、锌、锰等人体所需的矿质元素[3-4]。脂肪、总糖、粗纤维、多种矿质元素和氨基酸，兼具食药性质，可起到降血脂、抗氧化等作用，对高血脂等疾病有较好的功效[5]。

松针是松属植物的主要药用部位，富含活性成分，多种氨基酸、维生素等[6]，具有较高的保健价值。目前国外松针主要用于畜牧饲料研发，在我国松针主要应用于药用、食用，如松针茶、松针粉等[7-8]。福建是松树的主要分布范围之一，在食用菌栽培研究方面已有松木屑在绣球菌生产中的应用[9-10]，但在牛肝菌生产中的应用未见报道。

因此，通过在暗褐网柄牛肝菌母种培养基中添加松针浸出物，通过单因素试验观测菌丝生长状态及生长速率，初步确定适宜的添加量。再与其他添加物（马铃薯、葡萄糖、蛋白胨等）通过L9（34）正交试验确定最优暗褐网柄牛肝菌母种培养基配方，以期为后续暗褐网柄牛肝菌的菌种培养及活性成分鉴定、提取提供研究基础。

1 试验材料与方法

1.1 供试材料

暗褐网柄牛肝菌母种，为云南野生暗褐网柄牛肝菌子实体，2019年分离培养获得。

1.2 试验方法

1.2.1 基础母种培养基配制

去皮马铃薯200 g，水1 L，100℃下煮沸20 min后过滤。马铃薯滤液定容至1 L，加入葡萄糖20 g，琼脂16 g，蛋白胨1 g，121℃高温灭菌20 min。

1.2.2 松针添加量单因素试验

松针加水煮沸20 min，过滤后与200 g·L-1马铃薯滤汁混合，加入基础母种培养基中，配制成松针浸出液。浓度分别为 10 g·L-1、25 g·L-1、50 g·L-1、100 g·L-1的松针母种培养基，121℃高温灭菌20min。以基础母种培养基作为对照，探究不同浓度松针添加量对暗褐网柄牛肝菌菌丝生长情况的影响。

1.2.3 接种培养

将暗褐网柄牛肝菌菌块（5 mm） 接种于试验培养基上，置于27℃恒温黑暗条件下培养，每天观察菌丝生长势、菌丝颜色，利用“十”字交叉法统计菌丝生长速率等指标，每个处理5个重复。

1.2.4 正交试验确定最适培养基配方

在松针添加量的单因素试验基础上，通过L9（34）正交试验设计，因素水平见下表1。

表1 正交试验因素及水平L9(34)Tab.1 Orthogonal test factors and levels L9(34)

如表1所示，以菌丝生长势、菌丝先端整齐度、菌丝生长速度等作为试验指标，利用正交试验确定松针浸出液及其他添加物马铃薯、葡萄糖、蛋白胨的最佳配比添加量，优化确定最佳培养基配方。

1.2.5 试验数据处理和分析

试验数据采用Excel、SPSS 20.0进行分析处理。将菌丝生长势和菌丝边缘整齐度指标折算成数字（＋代表1，-代表0），每个处理5个重复，统计后进行方差分析。

2 结果分析

2.1 松针浸出液浓度单因素试验

不同松针浸出液对暗褐网柄牛肝菌母种菌丝生长的影响试验结果见表2。

表2 不同浓度松针浸出液对暗褐网柄牛肝菌母种生长情况的影响Tab.2 Effects of different concentrations of pine needle extract on the growth of Phlebopus portentosus stock culture

由表2可知，不同浓度松针浸出液对暗褐网柄牛肝菌菌丝生长的影响存在一定差异，随着松针浸出液的添加量的增加，暗褐网柄牛肝菌的菌丝生长速度呈现先增后降的趋势。在松针浸出液浓度为25 g·L-1时，菌丝生长速度最快，达到2.56 mm·d-1，菌丝生长势旺盛，菌丝颜色为黄色。当松针浸出液浓度达到100 g·L-1时，菌丝生长速度明显降低。

2.2 母种配方优化正交试验

正交试验结果见表3。

表3 正交试验结果Tab.3 Orthogonal test results

由表3菌丝生长速率各因素的极差R可知，影响菌丝生长速率的主次因素分别为D＞C＞B＞A，即马铃薯＞葡萄糖＞松针浸出液＞蛋白胨。最优方案为A2B1C1D3，即马铃薯添加量100 g·L-1，葡萄糖添加量 1 g·L-1，松针浸出液 25 g·L-1，蛋白胨添加量 2 g·L-1。

由表3菌丝生长势各因素的极差R可知，影响菌丝生长势的主次因素分别为C＞D＞B＞A，即葡萄糖＞马铃薯＞松针浸出液＞蛋白胨。最优方案为A3B2C1D2，即马铃薯添加量200 g·L-1，葡萄糖添加量1 g·L-1，松针浸出液 50 g·L-1，蛋白胨添加量 3 g·L-1。

由表3菌丝颜色试验结果可知，菌丝颜色与蛋白胨添加量存在一定的相关性。在一定范围内，蛋白胨添加量越大，菌丝颜色越黄。

2.3 方差分析

各因素对菌丝生长速率的影响方差分析见表4。

表4 菌丝生长速率单因素方差分析Tab.4 One way ANOVA of mycelial growth rate

由表4可知，葡萄糖、马铃薯2个因素对菌丝生长速率的影响是极显著的（显著性＜0.01），松针浸出液对菌丝生长速率影响显著（显著性＜0.05），蛋白胨的影响不显著（显著性＞0.05）。

各因素对菌丝生长势的影响方差分析见表5。

由表5可知，葡萄糖、马铃薯两个因素对菌丝生长势的影响是极显著的（显著性＜0.01），松针浸出液添加量对菌丝生长势的影响显著（显著性＜0.05），蛋白胨对菌丝生长势的影响不显著（显著性＞0.05），方差显著性分析结果与菌丝生长势单因素方差分析结果相同。

表5 菌丝生长势单因素方差分析Tab.5 One way ANOVA of mycelial growth potential

各因素对菌丝边缘整齐度和菌丝颜色的影响方差分析见表6。

表6 菌丝边缘整齐度单因素方差分析Tab.6 One way ANOVA of mycelial edge uniformity

由表6可知，葡萄糖和松针浸出液对菌丝边缘整齐度存在极显著影响（显著性＜0.01），蛋白胨和马铃薯滤汁对菌丝边缘整齐度影响不显著。

2.4 母种最佳培养基的确定及验证

对于菌丝生长速率，因素D（马铃薯）的影响最大，D3为最优值，对于菌丝生长势则D2最优。根据菌丝生长势因素D的K分析，D2（9.8） 与D3（9.6） 差异不明显，将D2和D3经过单因素方差分析验证，得到二者显著性为0.793（＞0.050），即菌丝生长势D2与D3差异不显著。综合因素D对菌丝生长速率和菌丝生长势的影响，因素D的最优方案确定为D3。因素C（葡萄糖）在菌丝生长速率和菌丝生长势指标中的最优方案都为C1。因素B（松针浸出液），在菌丝生长势指标中，B2最优，但同时考虑到K1与K2差异较小，经过单因素方差分析验证B1和B2差异不显著（显著性=0.601），故按照菌丝生长速率的最优方案确定B1为最优值。由上表4、5可知蛋白胨对菌丝生长速率和菌丝生长势影响不显著，故蛋白胨可选择生长速率最优方案A2，最终确定最优方案为A2B1C1D3。

按照A2B1C1D3配置母种培养基，选择基础培养基和PDA培养基作为对照，结果见表7。

表7 验证试验Tab.7 Validation test

由表7可知，使用配方A2B1C1D3，菌丝生长速率达到3.41 mm·d-1，菌丝颜色黄色，生长势强，故确定A2B1C1D3为暗褐网柄牛肝菌母种培养基最优方案。

3 小结与讨论

暗褐网柄牛肝菌母种生物学特性[11]、碳源、氮源添加量[12]试验等，前人已有开展。在前人研究基础上，结合本地区松针资源的应用，通过单因素试验和正交试验结合，进一步优化暗褐网柄牛肝菌母种的最优配方。

试验结果显示，在一定浓度范围内，母种培养基中适当添加松针浸出液，暗褐网柄牛肝菌菌丝生长速度显著提高，菌丝生长势较旺，在松针浸出液浓度达到25 g·L-1时，菌丝生长速度和生长势均表现较优。

通过L9（34）正交试验优化筛选出最佳培养基为马铃薯添加量100 g·L-1，葡萄糖添加量10 g·L-1，松针浸出液25 g·L-1，蛋白胨添加量2 g·L-1。通过进一步的验证试验，确定此方案为本次试验的最佳方案。该配方培养下，菌丝生长速率较快，菌丝生长势旺盛。

通过重点研究松针浸出液对暗褐网柄牛肝菌菌丝生长情况的影响，并对其作为添加物的培养基进行进一步优化，以期为今后松针浸出液在牛肝菌培养中的应用，及活性物质的进一步利用提供基础。