张召兴，张艳英，贾青辉*，史秋梅*，刘 雪

(1.河北旅游职业学院畜牧兽医系，河北承德 067000； 2.河北科技师范学院/河北省预防兽医学重点实验室，河北秦皇岛 066604)

肺炎克雷伯菌Klebsiellapneumonia属于克雷伯菌属，共有3个亚种，分别为肺炎克雷伯菌鼻硬结亚种、肺炎克雷伯菌肺炎亚种、肺炎克雷伯菌臭鼻亚种[1-2]。肺炎克雷伯菌不仅能够引起多种动物患病，而且也能导致人类患病，是一种人兽共患病病原。近年来肺炎克雷伯菌的感染率逐渐升高，已成为继大肠埃希氏菌外又一个条件性致病菌[3-5]，由于抗菌药物的使用不当，导致其产生广泛的耐药性。

氨基糖苷类药物主要是由两部分组成，其是一种苷类抗生素，包括氨基糖与氨基环醇，二者通过氧桥连接，有庆大霉素、链霉素、卡那霉素、阿米卡星、新霉素等。氨基糖苷类药物其具有抗菌谱广，活性较强的特点，然而随着氨基糖苷类抗生素的滥用，细菌对其逐渐产生耐药性。研究发现，细菌对氨基糖苷类药物的耐药机制有很多种，但是临床上细菌对氨基糖苷类药物耐药最重要的原因是产生氨基糖苷类钝化酶，其中最常见的是氨基糖苷乙酰转移酶基因[6]。

近几年,关于貉感染肺炎克雷伯菌的报道逐渐增多,但是关于耐药性及耐药基因报的较少。本试验以临床中分离的貉源致病性肺炎克雷伯菌为研究对象，进一步探讨氨基糖苷类抗菌药物的耐药机制，并对氨基糖苷类抗菌药物的耐药性与耐药基因检测，并分析相关性，研究结果为貉肺炎克雷伯菌病的防控提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 57株貉源致病性肺炎克雷伯菌临床分离菌株，由河北省预防兽医重点实验室保存。

1.1.2 主要试剂与仪器 营养琼脂、营养肉汤、麦康凯肌醇阿东醇羧苄青霉素琼脂基础(MIAC)均购于北京陆桥生化试剂有限公司；庆大霉素(CN)、阿米卡星(AMK)、链霉素(STR)、新霉素(NEO)、卡那霉素等氨基糖苷类药敏纸片购自北京天坛药物生物技术开发公司；DNA Marker DL 2 000,北京中科瑞泰生物科技有限公司；2×TaqMaster Mix、ddH2O,北京康为世纪生物科技有限公司；梯度PCR仪,德国Eppendorf公司；隔水式恒温培养箱,上海恒科学仪器有限公司；常规的试剂及仪器由河北省预防兽医重点实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 菌种复苏 将保存于-80℃的致病性肺炎克雷伯菌在麦康凯肌醇阿东醇羧苄青霉素琼脂基础(MIAC)培养基上，37℃恒温培养12 h，挑取单个菌落于有5 mL营养肉汤的10 mL管中，37℃进行扩大培养至对数期。

1.2.2 药敏试验 取对数期的菌株，调整菌液浓度为106CFU/mL，参照美国临床实验室标准化研究所推荐的KB药敏纸片法对57株致病性肺炎克雷伯菌进行药物敏感性试验，抑菌圈直径结果判断以细菌敏感(S)、中介(I)、耐药(R)表示。

1.2.3 细菌基因组DNA的提取 利用水煮法提取，取菌液1 000 μL离心，水洗2遍，加200 μL无菌水放入水浴锅100℃，10 min，取出后离心12 000 r/min，10 min留上清液，备用。

1.2.4 引物的设计 参照文献[7-9]，设计氨基糖类药物的耐药基因aadA1、aadA2、StrA、StrB、aac2、aac4、aadB、aadD、npmA、ant-Ia、aac(3)-Ia、aac(6)-Ib引物，由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.2.5 耐药基因的PCR检测 以提取的57株貉

源致病性肺炎克雷伯菌临床分离菌株基因组DNA为模板对12种氨基糖苷类耐药基因用降落PCR进行检测。用10 g/L的琼脂糖电泳检测目的条带，将检测阳性的菌株的PCR产物送生工生物工程(上海)有限公司进行测序，测序结果与GenBank中登录的参考株进行同源性比对。

1.2.6 数据分析与统计 将57株貉源致病性肺炎克雷伯菌临床分离菌株对氨基糖苷类药物耐药性与携带耐药基因进行统计，分析其相关性，计算其符合率。

2 结果

2.1 氨基糖苷类抗生素耐药性检测结果

57株致病性肺炎克雷伯菌对5种氨基糖苷类药物产生一定的耐药性。其中庆大霉素的耐药率为54.4%，链霉素的耐药率为49.1%，卡那霉素的耐药率为22.8%，阿米卡星的耐药率为8.8%，新霉素的耐药率为12.3%(表1)。

表1 57株致病性肺炎克雷伯菌对氨基糖苷类药物的药敏结果

2.2 氨基糖苷类抗生素耐药基因检测结果

临床分离的57株致病性肺炎克雷伯菌的菌株携带多种耐药基因，12种氨基糖苷类抗生素耐药基因11种被检测到(图1)。57株致病性肺炎克雷伯菌的菌株耐药基因测序结果与GenBank中登录的肺炎克雷伯菌参考株的同源性为97.9%～99.9%。通过统计，耐药基因aac(6)-Ib、aac4、aac2、aadB、StrB、aadA2、aadA1、StrA、ant-Ia、aac(3)-Ia、aadD的检出率分别为78.9%、77.2%、71.9%、70.2%、63.2%、59.6%、54.4%、28.1%、24.6%、21.1%和12.3%。耐药基因npmA未检出(表3)。57株致病性肺炎克雷伯菌的分离菌株均含有多重耐药基因，其中含有12，11，10，1种耐药基因的致病性肺炎克雷伯菌的分离菌株均为0株，含有9、8、7、6、5、4、3、2、0种耐药基因的菌株分别为5、3、10、16、6、10、3、3、1株，所占比例为8.8%、5.3%、17.5%、28.1%、10.5%、17.5%、5.3%、5.3%和1.8%。

2.3 耐药性与耐药基因相关性分析

通过对临床分离的57株致病性肺炎克雷伯菌株进行耐药表型及耐药基因进行相关性分析。庆大霉素、卡那霉素均与aac2耐药基因的符合率最高，分别为93.5%和84.6%，链霉素与StrB耐药基因的符合率最高为85.7%，阿米卡星与aadA1、StrB、aac2、aac4耐药基因的符合率最高，均为80.0%，新霉素与aadA1耐药基因的符合率最高为85.7%，与其他耐药基因无相关性(表4)。

M.DNA Maker DL 2 000 ; 1-12.Resistance genes aadA1,aadA2,StrA,StrB,aac2,aac4,aadB,aadD,npmA,ant-Ia,aac(3) -Ia,aac(6) -Ib,13.Blank control

表2 57株致病性肺炎克雷伯菌耐药基因检测结果Table 2 Detection results of drug resistance genes of 57 strains of pathogenic Klebsiella pneumoniae

表3 57株致病性肺炎克雷伯菌的多重耐药基因检测结果

表4 氨基糖苷类药物的耐药表型与耐药基因符合率结果

3 讨论

肺炎克雷伯菌主要引起毛皮动物的肺炎、子宫炎及其它化脓性炎症等，其发病率也呈上升趋势，仅次于大肠杆菌感染，是危害毛皮动物养殖业主要的病原菌之一[10]。在毛皮动物的养殖过程中，伴随着抗生素的广泛应用，越来越多的克雷伯菌对各类抗生素产生了较为严重的耐药性[11]，氨基糖苷类抗菌药物具有高效、广谱、作用广泛等优点，其抑菌机理主要通过破坏细菌细胞膜的完整性和抑制细菌蛋白质的合成，在人医和动物临床中被广泛应用，主要用于革兰氏阴性菌感染的治疗[12]。在临床中由于氨基糖苷类抗生素的不合理使用，对肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、绿脓杆菌等产生很强的耐药性。本试验表明，临床中分离的57株克雷伯菌对庆大霉素、链霉素、卡那霉素、阿米卡星、新霉素的耐药率分别为54.4%、49.1%、22.8%、8.8%、12.3%，说明分离的57株貉源致病性肺炎克雷伯菌对氨基糖苷类药物产生很强的耐药性。山东地区分离的貂源肺炎克雷伯菌对阿米卡星、庆大等氨基糖苷类抗生素耐药率均在70%，对其他药物耐药率较低[10]。可能由于对阿氨基糖苷类药物使用情况有关。

氨基糖苷类的耐药机制主要有两种，一是细菌可产生钝化酶使药物失活；二是细菌产生氨基糖苷类抗生素的修饰酶，主要包括磷酸转移酶、乙酰转移酶和核苷转移酶[10-12]。由于临床中氨基糖苷类药物的不合理的使用，致使细菌本身产生的氨基糖苷类钝化酶，导致其病原菌对氨基糖苷类药物 吸收量的减少，并引起 氨基糖苷类抗生素耐药[13]。进一步探讨肺炎克雷伯菌对氨基糖苷类抗菌药物产生耐药机制，并对氨基糖苷类抗菌药物的耐药性与耐药基因检测并分析相关性。结果显示，57株貉源致病性肺炎克雷伯菌耐药基因aadA1，aadA2，StrB，aac2，aac4，aadB，aac(6)-Ib的检出率在54.4%以上，其他耐药基因检出率为12.3%～28.1%，同时携带6种耐药基因分离菌株有16株，占总菌株的28.1%，说明临床分离的57株貉源致病性肺炎克雷伯菌携带耐药复杂，呈现多种基因型。其分离菌株的庆大霉素、链霉素、卡那霉素、阿米卡星、新霉素耐药表型与耐药基因aac2、StrB、aadA1、aac4的符合率均在80%以上，说明了57株致病性肺炎克雷伯菌对氨基糖苷类抗菌药物产生的耐药性与携带的耐药基因aac2、StrB、aadA1、aac4有关，其产生的耐药机制有待进一步研究。有报道人源肺炎克雷伯菌的耐药基因aac(6)-Ib检出率为 54.3%，氨基糖苷类产生耐药主要受aac(6)-Ib基因的影响[14]。从标本中分离出肺炎克雷伯菌40株对氨基糖苷类药物产生耐药的主要原因是携带aac(6)-Ⅰb基因有关[8]。本研究结果与以往的报道存在一定差异性，可能由于感染的宿主不同，携带耐药基因不同，产生的耐药性也有差异性。肺炎克雷伯菌携带耐药基因是否调控其耐药性有待一步研究。