张忠辉，高闪电，储岳峰，田占成，独军政，李有全，关贵全，罗建勋*，殷 宏,2*

(1.中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室，甘肃兰州 730046； 2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州 225009)

牛病毒性腹泻/黏膜病(Bovine viral diarrhea/mucosal disease，BVD/MD)是由牛病毒性腹泻病毒(BVDV)引起的牛传染性疾病，以发热、腹泻、消化道溃疡、流产、死胎等症状为特征，呈世界性分布[1]。BVDV为单股正链RNA病毒，属于黄病毒科瘟病毒属，与猪瘟病毒及边界病毒同属，根据BVDV分离株的细胞培养特性将其分为细胞病变(CP)和非细胞病变(NCP)两种生物型，而根据毒株的抗原性差异或基因组差异可将毒株分为不同的基因型和亚型，包括BVDV-1、BVDV-2、BVDV-3基因型以及BVDV-1a～BVDV-1w、BVDV-2a～BVDV-2d基因亚型[2-3]。BVDV-1在全球流行范围最广，造成牛呼吸道疾病、肠炎、胚胎感染症状；BVDV-2主要分布于南北美洲和亚洲国家，我国主要分布于青海、新疆、山东、河南等省区，主要导致血小板减少综合征、出血性肠炎；BVDV-3主要分布于巴西、泰国、意大利、孟加拉国、印度、阿根廷、土耳其等国家，我国主要分布于山东、河南等地，可导致呼吸道症状以及流产[1-3,5-7]。

本研究根据年龄、性别分层抽样，通过对来源于青海省牦牛557份血清样品检测BVDV抗体评估群体流行率，并利用RT-PCR扩增病毒5′-UTR进行了流行株的遗传演化分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 血清样品 牦牛血清样品557份，2018年采自青海省5州县牦牛养殖场未经BVD疫苗免疫动物，来源于海北州祁连县(170份)和刚察县(76份)、海南州贵南县(200份)、海西州(10份)、西宁市大通县(101份),用分层抽样法选择4县不同年龄和性别牦牛血清232份作为试验用样品。

1.1.2 主要试剂 爱德士BVDV抗体检测试剂盒，北京世纪元亨生物科技有限公司产品；RNAsimple总RNA提取试剂盒、DNA纯化回收试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司产品；RT-PCR试剂盒HiScript Ⅱ One Step RT-PCR Kit、DH5α 化学感受态细胞、质粒小量提取试剂盒，南京诺唯赞生物科技股份有限公司产品；DL 2 000 DNA Marker，宝生物工程(大连)有限公司产品；PGEM T-easy载体试剂盒，Promega公司产品。

1.1.3 主要仪器 Eppendorf nexus GXPCR仪，Eppendorf公司产品；DYY-12型电泳槽，北京六一生物科技有限公司产品；AlphaImager HP紫外凝胶成像仪，美国ProteinSimple公司产品；Multiskan Sky全波长酶标仪，Thermo公司产品。

1.2 方法

1.2.1 血清抗体检测 用分层抽样的方法，根据牦牛年龄和性别，抽样232份，用于BVDV抗体检测。由于海西州牦牛样本数量太少(10份)，可能对分析造成较大偏差，因此只用于后续分子检测。参照BVDV抗体检测试剂盒的操作说明，反应板样品孔中加入25 μL待检血清，阴性对照和阳性对照各两孔，按照标准操作步骤进行操作，最终读取OD450 nm值。根据公式S/P=(样品OD450-阴性平均OD450)/(阳性平均OD450-阴性平均OD450)进行计算，当S/P值大于0.3时判定为阳性。

1.2.2 流行率计算及分析 根据血清抗体检测结果，统计阳性率作为表观流行率(AP)，依据试剂盒的敏感性(SE=96.30%)和特异性(SP=99.50%)，用兽医流行病学调查与监测抽样计算器软件(由中国动物卫生与流行病学中心提供)，以公式(TP)=(AP+SP-1)/(SE+SP-1)估计BVDV在各牦牛群体中的真实流行率[8]。用Graphpad prism5.0进行卡方检验分析不同群体BVDV流行率的差异。

1.2.3 RNA提取及RT-PCR 按不同采样点对抽取的232份牦牛血清以及海西州10份牦牛血清进行分组，对各组血清分别采用混样方法检测，即每组血清每份取100 μL，以10份/管混样，按RNA提取试剂盒说明操作提取RNA，最终溶解于30 μL无RNAse水中备用。用牛病毒性腹泻病毒5′-UTR保守引物进行RT-PCR扩增(5′-UTRF:CTAGCCATGCCCTTAGTAGGACTA;5′-UTRR:CAAC TCCATGTGCCATGTACAGCA)，反应程序为50℃反转录30 min；95℃ 3 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，35个循环；72℃延伸10 min。琼脂糖凝胶电泳，对扩增产物分别切较回收293 bp大小的DNA片段，连接至PGEM Teasy载体进行序列测定，转化DH5α感受态细胞，提取质粒送兰州天启基因生物科技有限公司测序。

1.2.4 序列分析 用VecScreen、Blast、DNA Star、BioEdit等软件对获得序列进行分析，分析病毒序列与GenBank中收录参考株序列的同源性，用Mega 6生物信息学软件构建进化树，参考毒株信息见表1。

表1 参考毒株序列信息

2 结果

2.1 血清抗体检测

232份牦牛血清样品中BVDV总体表观流行率为82.30%，预测总体真实流行率为85.40%。各地预测牦牛BVDV真实流行率最高为海北祁连县(99.60%)，其次为贵南县(78.30%)和大通县(70.90%)，而刚察县(51.70%)较低，海北祁连县BVD流行率显著高于其他3个县(P<0.05)(表2)。雄性牦牛总体BVDV预测真实流行率为90.01%，显著高于雌性牦牛(80.70%)(P<0.05)。1岁～2岁雄性牦牛与雌性牦牛BVDV流行率未见差异，而在2岁～3岁龄、3岁～4岁龄、4岁龄以上雄性牦牛BVDV流行率均显著高于雌性牦牛(P<0.05)(表3)。

表2 各地牦牛BVDV抗体检测结果

表3 不同年龄和性别牦牛BVDV抗体统计结果

2.2 青海牦牛BVDV基因亚型分析

DNA测序后，经BLAST以及序列比对，去除相同序列，共获得22条不同的DNA序列。用Mega 6软件构建牦牛BVDV系统进化树，在青海牦牛流行BVDV可分为4个基因亚型，包括BVDV-1a(大通县)、BVDV-1m(大通县、贵南县、刚察县、海西州、祁连县)、BVDV-1q(贵南县、祁连县)，BVDV-2a(贵南县)(图1)。牦牛BVDV-2a株与我国早期流行新疆株XJ04、SH-28的5′-UTR核苷酸一致性为95.9%～97.1%，相似性较高。BVDV-1m检出率为54.1%，不同株间5′-UTR核苷酸一致性为95.1%～99.5%，其中在大通、贵南、海西、刚察等地毒株与牛源SD15株亲缘关系较近，而祁连牦牛BVDV亲缘关系与辽宁株或西昌牛源株亲缘关系较近。BVDV-1q亚型检出率与BVDV-1m相当但株间5′-UTR核苷酸一致性略低(88.9%～99.5%)，且该亚型株5′-UTR与早期分离株SD0803相似性(89.8%～98.5%)略高于西北双峰驼camel-6或牛源GS-3 株(89.3%～91.6%)。

3 讨论

BVDV除感染牛外，还可感染牦牛、羊、猪、鹿等家畜和多种野生偶蹄动物[9]。虽不同年龄的牛对BVDV均有易感性，但年龄、性别、经产等因素使BVDV有流行差异[10-11]。本研究对青海省4地牦牛样品利用分层抽样的方法，进行BVDV抗体流行病学调查，依据商品试剂盒的检测敏感性(96.3%)对测定的表观流行率进行校正以预测真实流行率，相对准确的评价牦牛BVDV的流行程度。与文献[12]相比，本研究发现BVDV在牦牛中的总体阳性率略高，表明在现有生产模式下牦牛群体实现BVDV自我净化存在难度。

牦牛群体BVDV流行表现为2岁以内抗体阳性率较低，可能与在未成年阶段母源抗体的保护有关。通过感染孕畜并在新生牛形成持续感染，犊牛在6月龄～24月龄发生致死性黏膜病，因此未成年牦牛虽表现较低BVDV感染率但发病风险不应忽视。此外，本研究发现在2岁龄以上成年牦牛的各年龄阶段，雄性群体的BVDV流行率均高于雌性群体，是否雄性成年牦牛存在较高的BVDV易感性，还需进一步研究。

图1 牦牛BVDV系统进化树

在我国，BVDV流行株主要有BVDV-1a～1d、BVDV-1m～1q、BVDV-1u～BVDV-1w、BVDV-2a～2b等亚型[2-4]。河南省、山东省相继报道山羊、绵羊以及肉牛因BVDV-3自然感染发病[6-7]。本研究在牦牛中未检出BVDV-3，可能与目前该亚型毒株在国内流行区域比较局限有关。与文献[12]相比，牦牛群体中除BVDV-1q亚型，还存在BVDV-1m作为主导亚型流行。在青海省牦牛占比可达90%，远高于奶牛数量，本研究发现1q株5′-UTR与我国西北地区奶牛分离株的相似性略低于猪源SD0803株，因此存在局限于牦牛群体内的BVDV演化的可能。

本研究通抗体检测和病毒基因序列分析，揭示了青海不同地区牦牛群体流行BVDV现状，丰富了青海省牦牛BVDV的基因亚型信息，可为牦牛BVDV防控提供科学依据。