蔡萧君，江柏华，陆振华，王 涛，张碧海，王旭玲

（黑龙江省中医药科学院，黑龙 江哈尔滨 150036）

目前肺纤维化的基础病理生理学尚不清楚。据估计，每10 万人中有2.9～42.7 人感染此病［1］。从确诊开始患者的平均生存期为2～3 年，目前还没有有效的治疗方法［2］。因此，研究该病的发病机制对于控制疾病的发展和有效药物研制具有至关重要的作用。网络药理学是今年来新兴的高通量技术，基于网络平台数据共享的飞速发展和计算机应用的快速普及，使得本技术在研究复杂疾病和复杂药物方面得到广泛应用。在疫情期间更是得到广泛的使用，并得到一系列良好的应用结果［3-10］。

几千年来，中医药为慢性肺疾病提供了有效的治疗方法，包括减轻临床症状、改善肺功能和锻炼能力。目前对中药配方和中药单体的研究已被证明是治疗肺纤维化的有效方法。丹贝益肺方出自黑龙江省中医药科学院，由江柏华教授自拟经验而成。此方为丹参30 g、黄芪30 g、平贝20 g、党参20 g、麦冬20 g、桔梗20 g，川芎15 g、桃仁15 g、五味子15 g、补骨脂15 g、地龙各15 g 组成。其对肺纤维化疗效确切［11-26］。因此，本研究采用网络药理学技术研究丹贝益肺方对肺纤维化大鼠的干预作用，为临床肺纤维化发病机制和丹贝益肺方的药效物质基础及作用机制提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 丹贝益肺方成分收集

检索CNKI 及TCMSP（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）关于丹贝益肺方的成分信息，以丹贝益肺方构成为检索条目进行检索，并绘制数据集，收录整理相关丹贝益肺方所含成分的信息。

1.2 活性成分筛选

根据药动学和药效学的常规理论认识，药物分子发挥药效的前提是可以被吸收进入血液，并在体内累积达到一定浓度后随血液循环到达靶器官进而发挥药效。因此能否被吸收入血是药物分子发挥药效的前提。本研究采用国际通用的类药五原则对中药所含上千种成分进行靶向筛查，以口服利用度（OB）≥30%且类药性（DL）≥0.18 的标准对药物所含化学成分进行筛选。获得符合标准的潜在药效成分。

1.3 预测靶标及靶基因的确定

本部分采用数据库检索和分子对接验证形式对丹贝益肺方所含符合标准的成分进行靶点预测。TTD 数据库（https：//db.idrblab.org/ttd/）与CTD数据库（http：//ctdbase.org/）收录了NCBI 基因数据和与疾病相关的现存已知的靶点信息数据，同时上述数据库与OMIM 人类在线孟德尔遗传数据库（https：//www.omim.org/）收录的全面数据基因相关联。本研究基于上述数据库对筛选后的活性成分进行靶点预测分析。同时将靶蛋白引入UniProt（https：//www.uniprot.org/）数据库追溯上游对应靶蛋白的唯一靶基因名称，并汇总和整理。

1.4 构建基于丹贝益肺方活性成分、靶标、疾病的网络关系

将丹贝益肺方活性成分与关键疾病靶点、疾病的数据信息带入Cytoscape3.2.1 软件，构建丹贝益肺方对肺纤维化干预作用的活性成分、关键靶点网络图。同时，为针对性确定丹贝益肺方的主要活性成分和与肺纤维化相关的疾病靶标，将丹贝益肺方体内作用靶蛋白带入Omicshare（https：//www.omicshare.com/）在线分析平台进行GO 富集分析，分别进行Gene Ontology 的分子功能分析，生物过程分析和细胞组成分析。聚焦于肺部疾病特别是肺纤维化相关的关键代谢或生物学过程。

1.5 肺纤维化相关靶蛋白互做分析及配体受体分子对接验证分析

对获取到的与肺纤维化相关的靶蛋白带入String（https：//string-db.org/）网站，进行蛋白互作分析（protein-protein interaction），用以辅助阐明丹贝益肺方对靶蛋白基靶基因的调控机制。同时从PDB 蛋白数据库（http：//www.rcsb.org/）检索获取靶蛋白的3D 结构文件，并与之配位的药物小分子模拟药物吸收后的体内过程进行对接，通过Discovery Studio 2.5 可视化软件对上述过程进行模拟，以标准化流程对分子对接过程的空间位点和结合能进行客观评价，并以结合能≤-5.0 kJ/mol 作为对接可能的最低标准。

2 结果

2.1 丹贝益肺方活性成分筛选结果

通过TCMSP 及CNKI 数据库检索确定丹贝益肺方所含化学成分，即丹参、平贝、桃仁、地龙、川芎、桔梗、黄芪、党参、补骨脂、麦冬、五味子。筛选符合OB≥30%、DL≥0.18 的成分进行整理。排除相同成分共得到成分72 个。其中丹参19 个、平贝20 个、桃仁33 个、川芎12 个、桔梗15 个、黄芪24 个、党参19 个、补骨脂6 个、麦冬10 个、五味子45 个。由于成分过多，现将基本信息置于表1 中。

表1 丹贝益肺方活性成分信息表Tab 1 Active components of Danbei Yifei formula

2.2 丹贝益肺方活性成分、靶标、疾病的网络关系分析结果

丹贝益肺方活性成分、靶标、疾病的网络关系网络中涉及133 个节点和899 条边。由Cytoscape 3.2.1 软件构建活性成分、靶标、疾病的网络关系图（图1），其中网络异质性为0.051，平均相邻节点数目为4.319，路径长度2.145，平均网络中心度为0.124。这表明丹贝益肺方的药效成分可能存在一个成分同时与多个体内靶蛋白相互作用的现象，也可能存在同意靶蛋白同时与多个成分相互作用的现象。由此看出方剂配伍的复杂性和网络分析的直观性。涉及疾病也与肺纤维化相关，如支气管痉挛（组胺引起）、过敏性气道炎症、支气管哮喘、慢性阻塞性肺病、哮喘、炎症、肺纤维化等。

图1 丹贝益肺方成分、靶标、疾病的网络关系Fig 1 Network relationship among components of Danbei Yifei formula，target and disease

2.3 富集及靶点相互作用关系分析结果

将上述预测的与肺纤维化相关的靶标带入软件ClueGO 2.3.5 中进行GO 富集分析，以通路的Pvalue 小于0.05 为标准筛选出核心条目共计26 个，分别描述基因的分子功能、细胞组分、参与的生物过程。其中生物过程22 条、内容为分别为二十醛生物合成过程、多细胞生物代谢过程、胶原代谢过程、胶原生物合成过程、吞噬功能的正调节、cAMP 生物合成过程的负调控、环化酶活性的调节、对铵离子的响应、磷脂酶C 激活G 蛋白偶联受体信号途径、环化酶活性的正向调节、吗啡反应响应、对铵离子的响应、平滑肌收缩、G 蛋白偶联受体信号途径，与环核苷酸第二信使偶联、磷脂酶C 激活G 蛋白偶联受体信号途径、细胞对铵离子的反应、唾液分泌、平滑肌收缩的调节、腺苷酸环化酶抑制G 蛋白偶联乙酰胆碱受体信号通路、磷脂酶C 激活G 蛋白偶联乙酰胆碱受体信号途径、血管收缩。细胞组分1 条，内容为轴突终端应答。分子功能3 条，内容分别为神经递质受体活性、G-蛋白偶联胺受体活性、磷脂酰肌醇磷脂酶C 活性。上述过程分析见图2。上述过程大概分为4 类，即G 蛋白偶联受体信号途径与环核苷酸第二信使偶联、二十醛生物合成过程、多细胞生物代谢过程、磷脂酶C 激活G 蛋白偶联受体信号途径，见图3。所有富集分析涉及代谢通路及信号通路见图4。

图2 丹贝益肺方成分、靶标、疾病的网络关系Fig 2 Bar chart of GO analysis of Danbei Yifei formula

图3 丹贝益肺方干预肺纤维化的GO 分析结果Fig 3 GO analysis results of Danbei Yifei formula in the intervention of pulmonary fibrosis

图4 丹贝益肺方干预肺纤维化的GO 分析结果Fig 4 GO enrichment analysis of Danbei Yifei formula in the intervention of pulmonary fibrosis

采用STRING（https：//string-db.org/）数据库对丹贝益肺方干预肺纤维化进行靶蛋白互做分析。如图5 所示，通过对蛋白互做网络可视化分析可知，肺纤维化已经证实的核心靶点是花生四烯酸5-脂氧合酶，其在丹贝益肺方的多味中药的作用靶蛋白群中均有体现，如五味子所含原儿茶酸、丹参所含氨基琥珀酸、党参所含辣椒素（辣椒素）和2，3-二羟丁二酸、黄芪所含芦丁、山奈酚、香豆素和槲皮素都同时对肺纤维化的核心靶点花生四烯酸5-脂氧合酶有直接作用关系。除此之外，与肺纤维化相关的其他疾病如支气管痉挛（组胺引起）、过敏性气道炎症、支气管哮喘、慢性阻塞性肺病、哮喘、炎症、肺纤维化等在丹贝益肺方中都有成分靶标的相互作用体现。由此推断丹贝益肺方配伍精当和协同起效的作用机制。

图5 丹贝益肺方干预肺纤维化的体内靶蛋白互做关系图Fig 5 In vivo target protein interaction diagram of Danbei Yifei formula in the intervention of pulmonary fibrosis

3 讨论

网络药理学结果显示丹贝益肺方所含活性成分涉及72 个，其中直接与肺纤维化疾病靶标相关的成分为五味子所含原儿茶酸、丹参所含氨基琥珀酸、党参所含辣椒素（辣椒素）和2，3-二羟丁二酸、黄芪所含芦丁、山奈酚、香豆素和槲皮素。目前针对肺纤维化的临床诊疗手段主要以西药为主，具有见效快、效果显著等特点，但同时也对患者带来易复发、副作用明显等弊端。因此，亟待发现新的对肺纤维化有效的治疗药物。丹贝益肺方是中医临床应用广泛的有效经典方剂，本次采用网络药理学技术研究发现其含有的众多成分都对肺纤维化有一定的作用疗效。其具体的作用机制如下文阐述。

花生四烯酸5-脂氧合酶激活蛋白又称5-脂氧合酶激活蛋白，是一种膜结合蛋白，5-脂氧基酶表达产生花生四烯酸，并以此调节合成的白三烯的量［27，28］，是炎症和结缔组织重塑的重要介质。最近的研究表明，花生四烯酸5 脂氧合酶激活蛋白基因的一些单苷酸多态性与哮喘和动脉粥样硬化等炎症疾病的风险增加有关［29-32］。中医理论认为肺与皮毛相表里，因此，肺病与皮肤系统疾病多存在内在联系。为此，有研究专项研究花生四烯酸5 脂氧合酶激活蛋白多态性与硬皮病之间的关系。实验假设花生四烯酸5 脂氧合酶激活蛋白的单核苷酸多态性可能与硬皮病和/或其主要器官并发症的风险相关。为了解决这一假设，在欧洲硬皮病试验和研究组的硬皮病患者队列中研究了七个单核苷酸多态性，它们被证明与其他炎症疾病的高风险相关［33］。

肿瘤坏死因子是一种促炎性细胞因子，在肺纤维化的病理生理学中被认为是一种关键的介质［34］。基于其作为疾病改良剂在肺纤维化治疗中的疗效，有研究曾以此为靶点，采用英夫利昔单抗阻断肿瘤坏死因子治疗1 例血清阳性RA 和肺纤维化患者［35］。