殷玉莲，孟 畑，马丽娜，范奕伟，程一凡，仲芫沅，陈红风

（上海中医药大学附属龙华医院，上海 200023）

慢性难愈性疮面是目前临床上常见的问题，也是外科临床中的主要难题，从特征看，整体的病程久、病因复杂，同时治愈难度高，给患者带来沉重的医疗负担。慢性难愈性疮面的迁延难愈使得患者生活质量下降［1］，因此，研究其发病机制、潜在的重要作用靶点，寻求合适的治疗方法是目前迫切的需求。研究表明，细菌感染是影响疮面愈合的主要因素之一［2］，类型主要涵盖了铜绿假单胞菌与金黄色葡萄球菌等［3］。多重耐药的超级细菌则导致组织锁定在高炎症状态而难以愈合［4］，这给临床治疗带来巨大挑战［5，6］。针对这一难题，九一丹作为中医经典外用药物之一，具有显著的祛腐生肌作用。九一丹的主要组分为升丹（氧化汞）和煅石膏（硫酸钙），课题组前期研究发现九一丹可作用于非哺乳期乳腺炎患者局部疮面组织中的巨噬细胞。巨噬细胞是一种常见的细胞群体，整体的功能状态具备高异质性，且可塑性强［7］，同时针对不同的局部微环境，巨噬细胞对应的功能表型也存在很大差异，发挥各种不同的功能引导生理病理环节的发生。疮面愈合过程中，巨噬细胞起初因为疮面局部炎症刺激，加速发挥吞噬功能，主动清除坏死组织，同时清理入侵的病原微生物，待炎症基本控制，巨噬细胞又极化为另一功能表型，可分泌多种细胞因子，这有利于后续的细胞修复，同时可促进细胞增殖，在血管与肉芽新生的过程中起促愈作用。据报道，巨噬细胞在感染小鼠清除金黄色葡萄球菌中起着重要作用［8］；而在疮面愈合过程中局部巨噬细胞含量以及表型极化的不同将影响疮面抗炎、修复的程序转归［9］。

本研究主要利用耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA）菌株感染皮损造模方法建立大鼠慢性难愈性疮面模型，观察九一丹有效组分对慢性难愈性疮面的疗效。通过对其疮面组织的形态、M1 巨噬细胞表型特异性因子含量以及免疫荧光双重染色测定，从九一丹影响巨噬细胞极化表型的改变，探讨其治疗MRSA 感染所致慢性难愈性疮面的疗效和作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

SD 大鼠共32 只，每只平均体重（200±20）g，全部购买于上海中医药大学实验动物研究中心。实验开始前对实验大鼠进行适应性喂养，时间持续7 d，每2 只作为单位直接在2.5 cm 木屑垫料的塑料笼内部进行饲养，同时确保小鼠的昼夜节律分别为12 h，饲养的过程中，其环境温度设定为18～24 ℃，相对湿度维持在50%～70%。研究的整个过程均经过上海中医药大学实验动物福利和伦理委员会的批准（PZSHUTCM191018006）。

1.2 药物

实验所用的九一丹、升丹与煅石膏全部购买于上海中医药大学附属龙华医院中药制剂室（已完成相应登记）。

1.3 关键试剂和仪器

白介素-6（interleukin-6，IL-6）、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α），大鼠ELISA 试剂盒全部购买自上海江莱生物科技有限公司，批号分别对应是JL21441 与JL13202 和JL20896；CD11C 抗体购于Bioss，批号为Bs-2508R；F4/80 抗体、Goat anti-Rat 以及Goat anti-Rabbit 均购 于 Abcam，批 号 为 Ab16911、Ab150157、Ab150080；关键仪器：组织切片机、TB-718 系列生物组织自动包埋机、RE52CS1 旋转蒸发仪与Neofuge 13R 低温冷冻离心机等。

1.4 造模方法及分组

大鼠慢性难愈性疮面造模参照文献［10］，采取4%水合氯醛（1 mL/100 g）对大鼠进行腹腔注射，然后去除大鼠背部的毛发，使用直径是2.5 cm 的圆形塑料环在大鼠颈与背部制造对应的皮损范围，然后选择无菌剪刀与手术刀裁剪对应区域的皮肤，要求深度达到筋膜层。大鼠皮损疮面上喷洒MRSA菌液，纱布覆盖，确保与皮肤缝之间贴合良好，然后使用胶布包扎固定。24 h 以后，疮疡模型制作完成。利用随机数字表法进行分类，将实验动物分成对照组、九一丹组、煅石膏组和升丹组，每组8 只。

1.5 干预方法

造模成功后，对照组予常规疮面消毒后无菌纱布覆盖并包扎。九一丹的构成主要包括锻石膏（硫酸钙）与升丹（即氧化汞）与锻石膏（硫酸钙），其配备比例为1∶9，具体用量首先参考九一丹外用安全性及规范性方案［11］中规定剂量1.5 mg /cm2，同时包括人与大鼠之间的体表面积进行折算，最终得出的等效剂量对应是9.255 mg/cm2。因此九一丹组在对照组基础上均匀布洒定量九一丹于疮面。煅石膏组按照九一丹组用药剂量取9 份煅石膏，升丹组按照九一丹组用药剂量取1 份升丹剂量。每日换药，并记录换药前、换药后第1 日、第3 日、第5 日、第7日疮面大小以及其上肉芽、脓腐、上皮的情况。

1.6 检测指标及方法

1.6.1 疮面愈合情况 各组分别于造模成功首日、换药第1、3、7 天用相机拍取疮面情况，然后进行后期的疮面愈合率计算，计算公式为：（初始日疮面大小－选材日疮面大小）/初始日疮面大小×100%。

1.6.2 疮面组织形态学观察 选择相应的标本，进行包埋、固定与切片等处理，使用光学显微镜观察不同的组织形态。

1.6.3 ELISA 法检测各指标 采集大鼠腹部主动脉血，离心处理，分离获取血清，后续步骤参照上海江莱生物科技有限公司ELISA 试剂盒说明书操作，选择450 nm 波长，检测血清中IL-6、iNOS 与TNF-α含量。

1.6.4 免疫荧光染色 对各组织进行取材、脱水、透明、浸蜡、包埋及切片；按1∶5 0 和1∶2 0 0 比例分别配制滴加F 4/8 0 和C D 1 1 c 抗体，4 ℃过夜。后续以1∶2 0 0 比例进行配制，滴加Goat anti-Rabbit和Goat anti-Rat 二抗工作液，在37 ℃进行孵育，时间持续2 小时。烘片后应用抗荧光猝灭封片剂封片。分别于100 倍、400 倍视野进行采集；采用ImageJ 软件，统计视野下黄色部分荧光光密度。

1.6.5 疮面细菌微生物培养 使用一次性无菌拭子在换药前、换药7 d 后疮面上进行取样，送PCR 检测微生物情况。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 大鼠一般情况及疮面愈合情况

换药观察7 d 后，升丹组死亡2 只，其他各组大鼠精神状况良好，进食等均无异常。各组大鼠均有疮面均存在愈合趋势，九一丹组、升丹组、煅石膏组疮面愈合率优于对照组，其中九一丹组愈合情况最佳。换药第3 天，各组间疮面大小差异无统计学意义（F＝1.931，P＝0.147 5）；换药第7 天，各组疮面愈合率具有显著性差异（F＝17.04，P＜0.001），九一丹组疮面愈合情况优于其余各组，见表1。

表1 各组大鼠疮面愈合情况（cm2，±s）Tab1 Lesions healing status in the four groups（cm2，±s）

表1 各组大鼠疮面愈合情况（cm2，±s）Tab1 Lesions healing status in the four groups（cm2，±s）

注：#换药第7 天，n＝6;*与对照组比，P＜0.05，△与九一丹组比较，P＜0.05。

愈合率（%）0.83±0.06△0.98±0.02*0.94±0.41*△0.96±0.04*组别对照组九一丹组升丹组#煅石膏组n8888换药第3 天4.70±0.80 3.78±0.98 3.73±0.96 4.12±0.64换药第7 天1.04±0.39△0.16±0.12*0.39±0.15*△0.28±0.23*

2.2 各组大鼠疮面组织形态学观察

各组大鼠疮面肉芽组织学观察、H & E 染色结果显示：末次换药后，对照组的中性粒细胞分布密集，提示炎症较重，九一丹组及升丹组的中性粒细胞分布松散，九一丹组纤维组织较多，提示炎症控制且具有愈合趋势，见图1。

图1 末次换药后对照组（DZ）、九一丹组（JYD）、煅石膏组（DSG）、升丹组（SD）H & E 染色结果（400×）Fig 1 Morphology changes of lesions in the four groups after the last administration（H & E，400×）

2.3 巨噬细胞表型因子含量比较

造模成功后，换药前各组血清中巨噬细胞M1特异标志物IL-6、iNOS 与TNF-α 含量，差异无统计学意义（IL-6：F＝1.481，P＝0.255 2；TNF-α：F＝0.361 1，P＝0.781 9；iNOS：F＝1.527，P＝0.243 6）。末次换药后，各组血清中TNF-α、IL-6、iNOS 含量均呈下降趋势，提示炎症得到控制。九一丹组换药后血清IL-6、TNF-α、iNOS 含量下降明显（P均＜0.05）；而对照组仅换药前、后血清TNF-α 含量组内比较具有统计学意义（P＝0.021 9）；煅石膏组（P＝0.030 7）与升丹组（P＝0.014 8）仅换药前、后血清IL-6 含量组内比较具有统计学意义。另外，换药后各组间血清特异标志物变化亦有差别，结果显示九一丹组换药后血清中IL-6、iNOS 含量与对照组存在统计学差异（IL-6：P＝0.014 8，iNOS：P＝0.021）；煅石膏组与九一丹组比较，血清中TNF-α 含量具有统计学差异（P＝0.021 3），升丹组与九一丹组比较，血清中iN O S 含量差异具有统计学意义（P＝0.049 3），见图2～4。

图2 换药前后各组IL-6 含量Fig 2 Changes in serum IL-6 concentrations in the four groups before and after medication

2.4 免疫荧光染色结果

图3 换药前后各组TNF-α 含量Fig 3 Changes in serum TNF-α concentrations in the four groups before and after medication

图4 换药前后各组iNOS 含量Fig 4 Changes in serum iNOS concentrations in the four groups before and after medication

末次换药后，免疫荧光染色亮绿色对应是F4/80 表达部位、亮红色对应是CD11c 表达部位、蓝色对应是细胞核染色表达，黄色对应是标记完成的M1 巨噬细胞。结果显示，M1 巨噬细胞荧光光密度分析结果各组间差异有统计学意义（F＝7.221，P＝0.000 4），各组间标记的IF 荧光光密度比较结果显示，九一丹组（P＝0.003 9）、升丹组（P＝0.047 4）与对照组比较，差异有统计学意义，见图5、6。

图5 各组免疫荧光染色结果Fig 5 Tissue immunofluorescence double staining results of the four groups

图6 各组免疫荧光染色IF 荧光光密度比较Fig 6 Optical density revealed by immunofluorescence staining double staining in the four groups

2.5 疮面细菌微生物培养结果

各组造模成功后均提示MRSA 感染。在换药干预后，重新采集疮面分泌物作细菌培养，结果显示，九一丹组转阴5 例，升丹组转阴5 例，煅石膏组转阴1 例，对照组无转阴病例。

3 讨论

巨噬细胞在创面修复期间发挥关键作用，这种细胞不仅可以清除并且吞噬微生物与坏死组织，也可以分泌相应的细胞因子，利用这种方式针对细胞进行修复，有效地刺激细胞增殖，促进血管化与肉芽自身的新生。同时，不同表型的巨噬细胞具备多种不同的生理功能。巨噬细胞类型主要涵盖了两种形式，分别对应是M1 型，也就是经典激活的巨噬细胞，同时包括M2 型，也就是选择性激活的巨噬细胞［12］。在炎症阶段，M1 型巨噬细胞可以直接分泌TNF-α、IL-6 等，参与后续的炎症反应。炎症发生以后会转化为M2 型，分泌比如Arg-1、CD206 等抑炎因子，参与组织修复和伤口愈合［13-15］。近年来，已有多项研究发现中医药干预疮面上巨噬细胞表型变化，对疮面愈合具有积极作用。刘宸等［9］分析了糖尿病大鼠创面愈合的整个过程，初期巨噬细胞整体数量比较少，在愈合后期则持续在创面上表达，其表型相关的各类细胞因子表达亦呈动态变化，提示巨噬细胞可能与糖尿病创面愈合有关联。蒙玉娇等［16］的研究结果表明，活血通络方和益气温阳方有利于小鼠皮肤慢性疮面实际的愈合，促进疮面从炎症期向增殖期方向发展。林燕等［17］亦综述了巨噬细胞胞葬作用与表型转换在慢性皮肤溃疡具有改善作用。

升丹是治疗外科“痈疽肿毒”的良药。《外科正宗·升白灵药法》中记录：“凡疮久不收口，用此研细掺上少许，其口易完，若入于一概收敛药中用之，其功奇甚捷。”意为如若遇疮久不收口的情况，利用升丹研细掺入其中，可有奇效。因此，既往就有外科不离红、白二丹的说法。升丹成分主要包括氧化汞，汞制剂本身有腐蚀性与毒性，因此在临床应用需要增加赋形药，将外用升丹制剂按比例配伍，根据脓腐的比例选择合适的药物。九一丹整体疗效较好，操作简单，价格低廉，因此临床应用非常广泛。研究结果显示［18，19］，升丹自身的药理作用主要包括：（1）杀菌：升丹内部的HgO 可以还原得到Hg2+和细菌呼吸酶内部的巯基结合，造成细菌死亡。（2）祛腐：硝酸汞属于可溶性盐类，加入水以后会进行分解得到酸性溶液，有一定的腐蚀作用，可将病变组织中的蛋白质坏死，同时和健康组织之间进行分离。（3）生肌：升丹制剂能刺激创面肉芽中毛细血管生成和扩张，减少微血栓，有利创面愈合。本课题组九一丹使用小剂量升丹，前期研究主要用于治疗乳房部慢性难愈性疮面，在临床已取得确切疗效［19-21］，证实九一丹具有良好的祛腐生肌作用。但既往尚未有九一丹作用机制的研究，因此本研究通过设立九一丹及其有效组分升丹组、煅石膏组及对照组进行对比，是对前期研究结果的补充。结果显示，九一丹组及升丹组对疮面MRSA 耐药菌具有较好的抑制作用；另外，本研究发现九一丹可抑制炎症状态下巨噬细胞细胞TNFα 的分泌，并降低IL-6、iNOS 等炎症物质的产生，免疫荧光染色标记结果也提示九一丹能够降低M1 巨噬细胞极化。与此同时，九一丹组疮面脱腐、愈合方面均优于单独对照组和煅石膏组；虽然升丹组表现出较好的脱腐效果，但组内大鼠致死率较高，其安全性较差。可见，九一丹中的升丹成分能够发挥良好的提脓祛腐作用，同时配伍煅石膏来稀释升丹浓度，减少局部毒副作用的产生。九一丹的经典配伍相辅相成，可发挥减毒稳效的效果。

综上，本研究通过动物实验发现九一丹及其有效组分可通过调控巨噬细胞M1 表型，对炎性疮面起到祛腐生肌的作用。同时通过有效组分拆方对照，明确九一丹配伍比例能够在安全性的基础上确保其有效性。并且从巨噬细胞表型极化角度探究九一丹及其有效组分的潜在作用环节及靶点，今后拟进行更深入的研究，为九一丹这一经典的中医传统外用药剂补充理论基础，有利于九一丹在外科临床领域的推广应用。