刘文轩，罗欣，杨啸吟，张一敏，朱立贤，毛衍伟，梁荣蓉*，马伟民，杨振刚

（1.山东农业大学食品科学与工程学院，山东 泰安 271018）（2.君博食品有限公司，山东 临清 252600）（3.阳信亿利源清真肉类有限公司，山东 阳信 251800）

随着近年来我国人民水平的提高，尤其是中产阶级群体的不断壮大，我国牛肉消费量逐渐增大，在消费量不断增长的同时，消费者日趋关注牛肉品质。雪花牛排因具有良好的外观、口感以及营养价值高而深受消费者喜爱。在众多品质指标（包括肉色、嫩和风味等）中，肉色是影响消费者购买与否的重要指标，消费者往往以肉色作为肉制品新鲜与否的重要指标[1]。消费者通常认为肉色为明亮的樱桃红色或者真空包装的紫红色表示肉制品新鲜可放心食用[2]。为使雪花牛肉贮藏期间呈现良好的肉色，许多厂家采用高氧气调包装（High oxygen modified atmosphere packaging，HiOx-MAP，80% O2/ 20%CO2）对其包装贮藏。该条件下的高浓度氧气可以与肉中的肌红蛋白结合，使肌红蛋白大部分以氧合肌红蛋白（Oxymyoglobin，OMb）的形式存在，使肉呈现明亮的樱桃红色，从而延长其肉色货架期[3]。但是，研究发现HiOx-MAP能够促进牛排展销期间的脂肪氧化[4]。而肉在贮藏过程中的脂肪氧化会产生一些初级和次级代谢产物，这些产物能促进肌红蛋白的氧化，从而导致肉色稳定性变差，最终导致肉色的褐变[5]。而与普通牛肉相比，雪花牛肉含有较高的肌内脂肪，高氧条件下，脂质氧化会比普通牛肉更加剧烈[6]，这可能会加剧肌红蛋白的氧化和雪花牛肉肉色的劣变，这对雪花牛肉的贮藏是不利的。

因此，为探究HiOx-MAP条件对雪花牛肉贮藏期间肉色稳定性的影响和该条件下的肉色货架期，本研究以两种不同脂肪含量的育肥牛肉（A1等级和A3等级）为研究对象，探究育肥牛肉在HiOx-MAP条件下的脂质氧化程度及其对肉色和肉色稳定性的影响，为HiOx-MAP在育肥牛肉包装中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

在山东某肉牛屠宰场，选取一批统一饲养的饲养、体重相似、21月龄的安和杂交牛，宰前集中育肥6个月后屠宰。宰后在0~4 ℃排酸72 h后分割，按照日本牛肉分级标准进行分级，分别选取 A1等级和A3等级的左半胴体背最长肌各6条（n=6）作为实验样品，真空热缩包装后在保温箱中（0~4 ℃）3 h内运回实验室。背最长肌修整后，分割为2.54 cm的牛排，分别进行HiOx-MAP包装后，在0~4 ℃黑暗环境中贮藏0、5和10 d。在每个时间点，检测生鲜牛排 pH值、肉色指标、不同状态肌红蛋白的比例、总还原力（The total reducing activity，TRA）和脂质氧化水平等指标。

包装材料：氧气阻隔膜（Lid 1050；Sealed Air Corp），气调包装盒（TQBC-0775；SealedAir Corp），聚乙烯薄膜（水蒸气透过率：23.5 g/(m2·24 h)，氧气透过率：16654 cm3/(m2·24 h·atm)，二氧化碳透过率：64637 cm3/(m2·24 h·atm)。

1.2 仪器与设备

DT-6D气调包装机，大江机械设备有限公司；VORTEX1涡旋振荡器，上海汉诺仪器有限公司；SenvenGo pH计，Mettler Toledo公司；SP62便携式积分球分光光度仪，X-Rite公司；T18高速分散机，IKA公司；BioTek Epoch2酶标仪，美国伯腾仪器有限公司；DHG-9240A电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；YP10002电子天平，上海光正医疗仪器有限公司；ST-255脂肪测定仪，FOSS公司；TGL-16MS台式高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Distillation Unit K-355凯氏定氮仪，BUCHI公司。

1.3 实验方法

1.3.1 pH值的测定

参考Chen[7]的方法，在每个贮藏时间点，使用校正率为95%以上的pH计测定牛排的pH值，每块牛排测定6个点，取其平均值。

1.3.2 水分含量的测定

参照 GB 5009.3-2016[8]中的直接干燥法进行水分含量的测定。

1.3.3 脂肪含量的测定

参照国标 GB 5009.6-2016[9]中索氏提取法进行测定。

1.3.4 蛋白含量的测定

参照国标GB 5009.5-2016[10]凯氏定氮法进行测定。

1.3.5 肉色指标和R630/580的测定

使用 SP62便携式积分球色差计测定牛排表面的肉色指标（L*值、a*值、b*值、C*值和H*值），注意避开筋腱和脂肪组织。在贮藏0 d时，需进行30 min发色后测定，5 d和10 d打开包装后直接测定。每块牛排随机测六个点，取其平均值。在测定时，同时读取生肉饼在580 nm和630 nm的反射率，计算630 nm与580 nm的比值为R630/580值。其中：

1.3.6 不同状态肌红蛋白比例的测定

使用 SP62便携式积分球色差计分别测定波长为473 nm、525 nm、572 nm和700 nm处的反射率，计算生鲜牛排中高铁肌红蛋白（Metmyoglobin，MMb）、脱氧肌红蛋白（Deoxymyoglobin，DMb）和OMb的比例，其计算公式如下：

1.3.7 肌红蛋白总还原力（TRA）的测定

根据王芳芳[11]的方法并作相应修改，取1 g肉样切碎，加入5 mL pH为5.8浓度为25 mmol/L的PIPES缓冲液后，使其在冷冻研磨仪在4 ℃破碎均匀。取5 mL均质液于10 mL容量瓶中，加入2 mL 5 mmol/L的铁氰化钾溶液，混合均匀后放入4 ℃生化培养箱中1 h，其中每隔10 min搅拌一次，使其混匀。孵育完成后，加入0.1 mL 0.5%的氨基磺酸铵和0.2 mL 0.5 mol/L的醋酸铅，在室温下放置5 min后，加入2.5 mL 20%的三氯乙酸溶液，用蒸馏水补足至10 mL，室温下放置5 min后，用Whatman 42#滤纸过滤，取滤液在420 nm下测定其吸光度。

TRA=1 mmol/L铁氰化钾的吸光度-样品吸光度

1.3.8 脂肪氧化值（Thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）的测定

根据Yang等[6]的方法稍作修改，在每个贮藏时间点，从生肉饼中随机称取4 g肉样，剔除筋腱和表面脂肪，加入20 mL蒸馏水后插入冰盒中，用均质机14000 r/min均质1 min。随后在均质液中加入16 mL 10%三氯乙酸，用玻璃棒搅拌均匀后使用Whatman 1#滤纸过滤。取4 mL滤液于离心管中，加入1 mL硫代巴比妥酸溶液，涡旋30 s使其混合均匀。混匀后将离心管80 ℃水浴90 min后取出，冷却至室温后，使用酶标仪测定 532 nm处的吸光度，以1,1,3,3-四乙氧基丙烷为标准品做标准曲线计算TBARS值，最终结果表示为mg MDA/kg样品。

1.4 数据统计分析

数据使用SAS 9.0混合模型进行分析，以贮藏时间、大理石花纹等级以及它们的交互作用为固定因素，牛为随机因子，进行各个指标的方差分析，p<0.05为差异水平显著，根据显著性用 Sigmaplot 12.5进行作图分析。

2 结果与分析

2.1 两种等级育肥牛排的化学组分

由表1可以看出，两种等级的牛排蛋白质含量差异不显著（p>0.05），但是A1和A3等级的牛排脂肪含量和水分含量差异显著（p<0.05）。A3等级的肌内脂肪含量为15.81%，显著高于A1等级，而水分含量为59.52%，显著低于A1等级。两者脂肪含量与水分含量的总和差异不显著（p>0.05）。这是由于雪花牛肉的脂肪沉积于肌纤维之间，部分取代了肌纤维之间的水分，导致肌肉中水分降低[12,13]。这与董瑷榕等人[14]的研究结果一致。他们也发现，在育肥牛肉中水分含量与脂肪含量之和基本恒定。因此，本研究选用的两个等级的牛排肌内脂肪含量存在显著差异，可以用于本研究。

表1 两种等级牛排的化学组分Table 1 The chemical composition of steaks from two different marbling grades

2.2 不同等级牛排HiOx-MAP贮藏期间包装盒顶隙空间气体成分的变化

由于肌肉组织的呼吸作用，气调包装中的气体成分并不是一成不变的，微生物繁殖以及包装膜的渗透，都会导致顶隙空间气体成分发生变化[15]。如表3所示，贮藏时间和等级的交互作用对顶隙空间O2含量和CO2含量影响不显著（p>0.05），仅贮藏时间对O2含量有主效应（p<0.05），随着贮藏时间的延长，O2含量显著下降，但贮藏至10 d时，氧气含量仍然在77%。CO2含量在各处理组中保持稳定。这与杨啸吟[16]的结果一致，O2含量的降低是由肌肉组织的呼吸作用以及肉制品自身氧化耗氧导致的。

表2 两种不同等级牛排HiOx-MAP贮藏期间包装盒内顶隙空间气体成分分析Table 2 Variation of gas composition in the package of steaks from two different marbling grades stored under HiOx-MAP

表3 两种不同等级牛排HiOx-MAP贮藏期间pH值的变化Table 3 Variation of pH values of steaks from two different marbling grades stored under HiOx-MAP

2.3 两种等级牛排 HiOx-MAP贮藏期间 pH值的变化

pH值是影响肉色的重要因素，排酸24 h后，较高的pH会形成肉色发暗的DFD（dark，firm and dry）异质肉。表3显示，贮藏时间和等级的交互作用对pH值影响不显著（p>0.05），但贮藏时间对其影响显著（p<0.05），随着贮藏时间的延长，pH值显著升高，但始终在正常范围 5.4~5.6之间。Yuan等人[17]以牛背最长肌、半膜肌为研究对象，探究了4 ℃条件下，pH值随着贮藏时间的变化情况，他们也发现随着贮藏时间的延长，4 ℃条件下的pH值显著升高（p<0.05）。牛肉因其含有丰富的蛋白质，在贮藏期间易发生微生物污染，微生物对蛋白质的代谢，会产生游离氨基酸、胺类等碱性物质，导致pH值的升高[18]。

2.4 不同等级牛排HiOx-MAP贮藏期间肉色的变化

a*值表示肉样的红度值，a*值越大，表示肉色越鲜红。贮藏时间和等级的交互作用对a*值影响显著（p<0.05）。随着贮藏时间的延长，两种牛排的a*值呈现先上升后下降的趋势，这是由于在贮藏初期，HiOx环境下有利于OMb的形成，而OMb呈现明亮的樱桃红色[19,20]，使牛排a*值呈上升趋势。随着贮藏时间的延长，OMb长期处于高浓度氧的情况下，被氧化为MMb，使MMb逐渐积累，最后使肉色呈现不良的棕褐色。在贮藏初期，两种等级的牛排a*值差异不显著，随着贮藏时间的延长，A3牛排的a*值显著低于A1，贮藏至10 d时，A1牛排的a*值仅下降至17.43，而A3牛排的a*值却下降至12.22，已经低于消费者对生鲜肉肉色的可接受阈值，a*值>14.5[21]。这说明高脂肪含量的雪花牛排，在HiOx-MAP下更容易发生氧化，肉色褐变程度越大。Wang等人[22]得出了与我们相似的结论，认为a*值与脂肪氧化值呈显著负相关，随着脂质氧化程度的增大，a*值显著降低。

图2所展示的肉色变化趋势与a*值变化趋势一致。图2显示，在前5 d贮藏期内，两个等级的牛排肉色均呈现鲜红色，是消费者喜欢的色泽；在贮藏10 d时，两个等级的牛排肉色均出现劣变趋势，但是A3等级的肉色劣变显著快于A1等级，A3等级已经出现肉眼可见的明显褐色，而 A1等级的肉色仍为可接受的鲜红色。因此，高氧气调包装条件下A3等级的牛排贮藏至10 d时可能会导致消费者接受度降低，而A1等级的牛排仍可被接受。

L*值表示肉样的亮度值。贮藏时间和等级的交互作用对L*值影响不显著（p>0.05，表4），只有贮藏时间对其影响显著（p<0.05）。随着贮藏时间的延长，L*值显著升高。Esmer等人[23]的研究也表明，L*值受贮藏时间影响显著。生鲜肉贮藏至5 d时，L*值显著升高（p<0.05），贮藏至10 d时，L*值依然保持上升的趋势，但此时肉色已经变暗。杨啸吟等[24]的研究也得出了相同的结论，HiOx-MAP条件下，牛排的L*值在0~10 d内显著升高，而a*值从5 d开始显著下降。这可能是由于牛排汁液渗出较多，表面水分增加了光的反射率导致L*值升高[25]。

表4 两种不同等级牛排HiOx-MAP贮藏期间L*值，b*值，C*值，H*值和R630/580值的变化Table 4 Variation of L*， b*， C*， H* and R630/580 values of steaks from two different marbling grades stored under HiOx-MAP

b*值表示肉样的黄度值。如表4所示，贮藏时间和等级因素交互作用对b*值影响不显著（p>0.05，表4），但贮藏时间对其影响显著（p<0.05）。如表4所示，随着贮藏时间的延长，生鲜肉的b*值与a*值呈现相同的变化趋势。有人认为，b*值与a*值呈正相关，并且b*值与MMb的含量呈负相关，b*值的降低代表着 MMb的生成[23,26]。由此可以看出，两种牛排在前5 d时能够保持良好的肉色，而贮藏至10 d时，肉色发生劣变。

C*值用来表示色彩饱和度，C*值越大，表示肉色的色彩饱和度越高，说明肉色越鲜红。贮藏时间和等级两因素交互作用对C*值影响显著（p<0.05），生鲜肉的C*值变化趋势与a*值相同。随着贮藏时间的延长，两种等级牛排的C*值均呈现先上升后下降的趋势，在贮藏至10 d时，A3等级牛排C*值降低更显著。这也说明了这两种牛排在HiOx-MAP中只能在较短时间保持鲜红的肉色，随着贮藏时间的增加，肉色都会劣变，但脂肪含量更高的 A3等级牛排劣变程度更大。

H*值用来表示肉色的变化情况，H*值越接近于0，表示肉色越鲜红，越接近于 90，表示肉色越褐变[27]。贮藏时间和等级对生鲜肉H*值影响显著（p<0.05）。在贮藏前期，生鲜肉的H*值变化趋势不明显并且两种等级牛排之间差异不显著，贮藏至10 d时，两种等级牛排的H*值显著增加并且A3等级牛排显著高于A1等级牛排。这表明在贮藏后期，两种等级牛排都积累了大量 MMb导致肉色劣变，而A3等级牛排肉色劣变程度更大。

R630/580值可以用来间接表示生鲜肉中 MMb所占的比例。R630/580值越低，MMb所占的比例越高，消费者的可接受程度越低。由表4可知，贮藏时间和等级对R630/580值影响显著（p<0.05）。两种等级生鲜牛排的 R630/580值均随贮藏时间的延长而降低，贮藏至10 d时，A3牛排的R630/580值显著低于A1，并且低于消费者对于生鲜肉的接受阈值（R630/580>3）[11]。这说明 A3等级的牛排在贮藏后期，MMb开始大量积累，造成肉色的劣变，这与图1中的a*值的变化规律一致。

2.5 不同等级牛排HiOx-MAP贮藏期间TRA的变化

肌红蛋白TRA对肉色稳定性具有中要的作用。贮藏时间和等级的交互作用对 TRA影响不显著（p>0.05），但二者分别其有主效应（p<0.05）。如图3所示，随着贮藏时间的延长，两种牛排的TRA显著下降，且在整个贮藏期间，A3牛排的TRA显著低于 A1。TRA的下降不利于肌红蛋白的稳定，会导致 MMb的积累，从而导生鲜肉色劣变现象的发生。因此，在贮藏至10 d，两种等级的生鲜牛排肉色显著下降，且 A3等级牛排的下降速率更大。有学者研究了TRA与a*值的关系，结果表明，TRA的提高有利于生鲜肉a*值的提高[28]。整体来看，A1牛排的TRA显著高于A3牛排，所以，较高的脂肪含量不利于肌红蛋白TRA的维持，这是导致A3级牛排肉色劣变速率较快的原因。

2.6 不同等级牛排HiOx-MAP贮藏期间不同状态的肌红蛋白比例的变化

肌肉中的肌红蛋白比例对肉色起到了至关重要的作用。肌红蛋白是一种单体血红素蛋白，动物屠宰放血后，肌红蛋白状态对肉色起决定性作用[29]。如表5所示，贮藏时间和等级的交互作用对MMb%影响显著（p<0.05）。整体来看，A3牛排的MMb%显著高于 A1牛排，贮藏前期两种牛排之间无显著差异，但是在贮藏至10 d时，A3牛排的MMb%显著高于A1牛排，且A3牛排的MMb%已超过40%，导致 A3牛排此时出现了显著的肉色劣变。Greene等[30]的研究表明，当MMb含量超过40%时，肉色就不会被消费者接受。MMb%与脂质氧化程度有关，Zakrys等[31]认为，脂质氧化产生的不饱和醛（如4-羟基壬烯醛），能够促进肌红蛋白向MMb的转化。随着贮藏时间的延长，两个等级牛排的MMb%显著升高。这与图1的结果基本一致。

表5 两种不同等级牛排HiOx-MAP贮藏期间不同状态肌红蛋白比例的变化Table 5 Variation of the ratio of different myoglobin forms of steaks from two different marbling grades of steaks stored under HiOx-MAP

贮藏时间和等级的交互作用对OMb%影响显著（p<0.05）。随着贮藏时间的延长，OMb%显著降低，这是因为长期暴露在高浓度氧气的环境中，OMb部分被氧化为MMb，导致MMb的积累，使肉色由明亮的樱桃红色变成棕褐色。在整个贮藏期间，A3牛排中的OMb%下降速率大于A1。这说明A3牛排中，OMb向MMb转化的速率更快。在整个贮藏期间，脂肪含量较低的A1牛排OMb%降低了7.75%，而脂肪含量较低的A3牛排21.48%，显著大于A1。OMb%的降低趋势与a*值的降低趋势和 MMb%的增加趋势相一致。

贮藏时间和等级的交互作用对DMb%影响不显著（p>0.05），但等级对其影响显著（p<0.05）。虽然两个等级的牛排中，DMb%均不高，但 A1牛排的DMb%显著高于A3牛排，这说明脂肪含量较低的 A1牛肉能保持较高的肌红蛋白还原状态，这有利于维持牛排贮藏期间的肉色稳定性。

2.7 不同等级牛排 HiOx-MAP贮藏期间TBARS值的变化

丙二醛（malondialdehyde，MDA）是脂肪氧化产生的一种次级代谢产物，以 MDA产生的毫克当量数来表征 TBARS值和脂质氧化程度。有研究表明，当包装体系中的O2含量超过21%时，就容易发生脂肪氧化，产生 MDA[15]。由图5可以看出，贮藏时间和等级的交互作用对 TBARS值影响显著（p<0.05），随着贮藏时间的延长，两种牛排中MDA含量显著增大，说明两种等级的牛排脂肪氧化程度显著增大（p<0.05）。在贮藏10 d时，A3牛排脂肪氧化程度显著高于A1（p<0.05）。这说明两个等级间由于脂肪含量的不同造成了两个等级牛肉之间显著的脂质氧化程度差异。而研究表明，脂肪氧化程度越高，肉色稳定性越差[32]。Fourati等[33]认为脂质氧化产生的化合物与蛋白氧化具有较强的相关性。由此我们可以推测，随着脂质氧化程度的增大，肌红蛋白氧化程度显著增大，从而加速了雪花牛肉的褐变。Wang等[34]以兔肉为研究对象探究MDA对肌红蛋白的影响，结果表明，MDA能够促进MMb的形成。由此可以看出，脂肪氧化能够通过增加MMb的含量导致生鲜牛排的失色褐变。这是导致本研究中，A3级牛肉肉色稳定性差于A1等级的重要原因。

3 结论

育肥牛肉大理石花纹等级越高，其在高氧气调包装下的脂质氧化程度越大，降低了高铁肌红蛋白总还原力，促进了肌红蛋白的氧化和高铁肌红蛋白的积累，加快了HiOx-MAP贮藏期间肉色的劣变。在HiOx-MAP中，随着贮藏时间的延长，两种等级牛排的肉色稳定性逐渐降低，在贮藏后期，高脂肪含量的A3的a*值显著下降，肉色劣变严重，而A1能保持相对良好的肉色。基于该研究结果，我们认为，HiOx-MAP中，脂肪含量较低的A1等级的牛排在 10 d内能保持良好的肉色，而脂肪含量高的A3等级牛排只能进行短时间的贮藏。因此，我们建议脂肪含量较高的高档雪花牛肉若在较短时间（5 d内）贮藏可以采用HiOx-MAP来保持鲜红的肉色，但是，若需要长时间贮藏，应选用无氧包装方式，避免脂质氧化造成的肉色劣变。