刘灵，王萌，宋自娟，单媛媛*

（1.西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100）（2.陕西华州医药生物工程有限公司，陕西 西安 710054）

大豆异黄酮是大豆自然生长过程中生成的一种与雌激素结构相似的多酚类次生物，营养价值丰富，对机体蛋白质代谢、激素合成、细胞生长等方面都能产生一定程度的影响[1]。大豆异黄酮具有抗氧化损伤[2，3]、抗炎[4]、免疫调节[5]等作用，在食品、医疗、饲料等领域均有十分广阔的研究及应用前景[6]。例如，大豆异黄酮可用于改善心血管疾病[7]、骨质疏松[8]、阿尔兹海默症[9]，以及烦躁、失眠等妇女更年期综合征[10]，还可以预防子宫内膜癌[11]、乳腺癌[12]、肝癌[13]等癌症的发生。此外，在快节奏的现代生活中，免疫力低下的亚健康人群逐渐增多，大豆异黄酮在提高机体免疫功能方面的活性也逐渐受到研究者的关注，已有文献证明，大豆异黄酮可以促进细胞因子、特异性抗原等免疫分子的释放[14，15]，增强淋巴细胞等免疫细胞的活性[16]，调节胸腺等免疫器官的功能[17]。

但是，作为一种多酚类化合物，大豆异黄酮对环境较为敏感，在光照、高温等条件下极易发生氧化、聚合等反应，从而丧失生物活性[18]。采用软胶囊对多酚类物质进行包埋是提高其稳定性和加工适用性的重要手段。本研究团队前期以明胶和甘油为主要壁材，对苷元型大豆异黄酮进行了有效的包埋，制备了大豆异黄酮苷元复合软胶囊。目前，有关大豆异黄酮的免疫性能评价已经比较全面，但是关于胶囊化后的大豆异黄酮的研究更多集中在医疗功能上[19，20]，对于其是否保留了增强免疫力的能力尚不清楚。同时，袁根良等[21]、李力[22]等研究的大豆异黄酮复合胶囊虽已被证明无毒，但本研究所制备的大豆异黄酮复合软胶囊的有效成分及含量均有所不同，其潜在的安全性仍需进行系统的试验分析。因此，本研究依据《保健食品检验与评价技术规范》[23]，对以大豆异黄酮、大豆油、蜂蜡为芯材，以明胶、甘油、纯化水、焦糖色、二氧化钛为壁材制备的大豆异黄酮复合软胶囊进行系统的提高免疫功能研究及安全性评价，以期为大豆异黄酮复合软胶囊的合理安全应用提供科学的数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验材料

大豆异黄酮复合软胶囊，自制，其标志性成分及含量为：大豆异黄酮2.20%、大豆苷0.55%、染料木苷0.70%、大豆苷元0.35%、染料木素0.60%。

1.1.2 实验动物

SPF级SD大鼠和昆明种小鼠（200只雌性小鼠用于免疫功能评价试验，其余均用于安全性试验），由西安交通大学医学院实验动物中心提供，生产许可证号为：SCXK(陕)2018-001，动物饲料、垫料均由西安交通大学医学院实验动物中心提供。试验动物房为屏障系统，使用许可证号为 SYXK(陕)2018-009，温度20～25 ℃，相对湿度45%～65%。

1.1.3 主要试剂

生化试剂盒，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；血细胞分析试剂盒、环磷酰胺、敌克松、叠氮化钠、1，8-二羟基蒽醌、2-氨基芴，上海一基实业有限公同；TA97、TA98、TA100、TA102四种菌株，上海北诺生物科技有限公司购自Molecular Toxicology公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫功能评价试验

（1）动物分组与给药

将 200只雌性小鼠随机分为五大组，每大组 40只，每一大组再随机分为4小组，每小组10只。第1大组用于ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验、NK细胞活性测定；第2大组用于迟发型变态反应（DTH）测定、淋巴器官/体重比值测定；第3大组用于抗体生成细胞（PFC）检测、血清溶血素测定；第4大组用于碳廓清试验；第5大组用于腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验。设置1000、670、340 mg/kg·bw三个高、中、低剂量组，分别相当于人体推荐用量的30、20、10倍。大豆异黄酮复合软胶囊各所需浓度均用大豆油进行配置，受试鼠每日经口灌胃一次，连续30 d，阴性对照组给予等量大豆油。试验完成后称重并处死小鼠，取出胸腺和脾脏，称重并计算脏器/体重比。

（2）细胞免疫试验

DTH测定：于第26 d，先后用0.2 mL、20 μL 2%（V/V）SRBC间隔4 d对小鼠进行致敏和攻击。于攻击前、后24 h分别测量每只动物左后足跖部位厚度，每个部位测三次，计算足跖厚度差值。

ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验（MTT法）：取出脾脏，研磨、洗涤，用RPMI1640培养液调整细胞浓度为3×106cells/mL，参照刘颖芬等[24]的试验方法将其加入24孔培养板中，之后将其置于37 ℃孵育箱（5% CO2）中孵育72 h，于第68 h时，从每孔中吸出上清液0.7 mL，随即加入与吸出上清液同体积的RPMI1640培养液和50 μL MTT（5 mg/mL），继续孵育至结束，每孔加入1 mL酸性(CH3)2CHOH，溶解混匀，在570 nm波长下测定光密度值。

（3）体液免疫实验

PFC检测：将0.2 mL 2%（V/V）的SRBC注射进每只小鼠的腹腔内，免疫4 d后处死取脾，研磨、洗涤，同小鼠脾淋巴细胞转化试验中的方法调整细胞浓度为5×106个/mL。参照刘颖芬等[24]的PFC检测方法处理细胞液，最后取得溶血空斑数数值。

血清溶血素的测定：第26 d，四天的免疫方法同PFC检测中所用的方法，之后摘眼球取血，分离血清并倍比稀释，将100 μL不同稀释度的血清、100 μL 0.5%（V/V）的SRBC悬液先后置于微量血凝板的每孔内，充分混合均匀，置于平盘内，放入37 ℃恒温箱中培养3 h后进行血清溶血素的测定。

（4）单核-巨噬细胞功能测定

小鼠碳廓清试验：给各组受试动物尾静脉注射印度墨汁10 mL/kg·bw，分别于第2、10 min采取20 μL静脉血，随后将其与2 mL 0.1% NaHCO3溶液充分混合均匀，空白对照组采用NaHCO3溶液。设置紫外分光光度计波长为600 nm，测定并记录光密度值（OD），将处死小鼠后所取的肝脏和脾脏别称重，按照公式计算吞噬指数。

式中：

OD1——血样在2 min时测定的光密度；

OD2——血样在10 min时测定的光密度。

小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验：每只小鼠腹腔注射1 mL 20%（V/V）鸡红细胞悬液，间隔30 min处死，腹腔注射 2 mL生理盐水。吸腹腔洗液涂片，37 ℃下培养30 min，固定，Giemsa染色。记录100个巨噬细胞中吞噬鸡红细胞数和巨噬细胞吞噬的鸡红细胞总数及其被消化的程度。

（5）NK细胞活性测定

按照刘颖芬等[24]的研究中的NK细胞活性测定方法进行测定大部分处理，最后在490 nm处测定光密度值（OD）。NK细胞活性计算公式如下：

1.2.2 安全性评价试验

（1）大鼠急性毒性试验

参照《保健食品检验与评价技技规范》的试验方法[23]。取雌雄各半的SD大鼠20只，以最大耐受剂量（MTD）19.76 g/kg·bw（相当于人体推荐量的 593.4倍）的剂量经口灌胃，记录14 d内受试大鼠出现的的表现、行为异常等中毒症状和死亡情况，分别在1 d、7 d、14 d给受试动物称重，随后处死动物并进行大致解剖，观察肝、肾、脾、心、肺等脏器的变化情况。

（2）遗传毒性试验

Ames试验：采用平板掺入法，体外代谢活化系统选用多氯联苯诱导的大鼠肝微粒体酶（S-9），菌株为 TA97、TA98、TA100、TA102四种，大豆异黄酮复合软胶囊试验时用 DMSO配制成所需浓度。设置5000、1000、200、40、8 μg/皿五个剂量组，另外设置溶剂对照组（DMSO）、自发回变组、阳性对照组。计数回变菌落数。

小鼠骨髓细胞微核试验：采用30 h给样品法，设置10.0、5.0、2.5 g/kg·bw三个剂量组，另设溶剂对照组（大豆油）及环磷酰胺阳性对照组（CP，40 mg/kg·bw）。经口灌胃，第一次灌胃24 h后再次给样，6 h后处死动物并取股骨骨髓制片。每只动物统计1000个嗜多染红细胞（PCE）中的微核细胞数，计算干分率，计数 200个嗜多染红细胞，计算嗜多染红细胞/成熟红细胞（PCE/NCE）的值。

小鼠精子畸形试验：设置10.0、5.0、2.5 g/kg·bw三个剂量组，另设溶剂对照组及CP（40 mg/kg·bw）阳性对照组，连续经口灌胃5 d，每日一次，对照组给样等量大豆油。初次灌胃35 d后，处死小鼠并取双侧附睾制片，记录1000条完整精子的畸形数、畸形类型，计算畸形率。

（3）常规临床指标测定

设3.33、1.67、0.84 g/kg·bw（分别相当于人体推荐用量100、50、25倍）三个剂量组，另设溶剂对照组。连续灌胃30 d，每日观察动物的生长发育状况，注重观察中毒症状，每周称量一次受试鼠体重和记录一次二次食物摄入量。试验末期，将大鼠禁食16 h，空腹称重后采血并处死，测定血液学指标、血液生化学指标，解剖动物观察内脏，称肝、肾、脾、睾丸（卵巢）湿重值并做组织病理学检查，计算脏器/体重比值。

1.3 数据处理与结果判定

免疫力评价实验均采用方差分析，小鼠骨髓细胞微核试验采用卡方检验，小鼠精子畸形试验釆用秩和检验。依据文献[23]中的标准判断，细胞免疫功能检测、体液免疫功能检测、单核-巨噬细胞功能检测、NK细胞活性检测4个方面任何2个方面的结果为阳性，即可判定该受试样品能够增强免疫力。

2 结果与讨论

2.1 大豆异黄酮复合软胶囊对小鼠免疫功能的影响

2.1.1 大豆异黄酮复合软胶囊对小鼠体重和脏器比值的影响

胸腺和脾脏在机体免疫中贡献了免疫场所和免疫细胞，发挥了十分重要的免疫作用，免疫学中常用其重量变化来评价受试物对动物免疫功能造成的影响[16，25]。大豆异黄酮复合软胶囊对小鼠体重和脏器比值的影响如表1所示，各剂量组的小鼠各时期体重及增重与阴性对照组相比，差异不显著（p＞0.05），各剂量组与阴性对照组的小鼠脏器/体重比值维持在同一水平，差异无统计学意义（p＞0.05）。表明大豆异黄酮复合软胶囊对小鼠体重、脏器/体重比值无显著影响，不能通过增加免疫器官重量来增强免疫力。

表1 受试物对小鼠体重的影响Table 1 Effect of test substance on body weight of mice (±s)

表1 受试物对小鼠体重的影响Table 1 Effect of test substance on body weight of mice (±s)

注：与阴性对照组比较p＞0.05。表2同。

组别 剂量/(g/kg·bw) 动物数/只 初始重/g 中期重/g 末期重/g 增重/g 胸腺/体重(×10-3) p 值 脾脏/体重(×10-3) p 值高剂量 1.00 10 19.90±1.40 26.20±2.00 34.00+2.40 14.10±2.60 2.40±0.50 0.91 3.88±0.60 0.38中剂量 0.67 10 19.40±1.30 27.90±2.10 34.20±2.70 14.80±2.80 2.15±0.52 0.88 3.61±0.46 1.00低剂量 0.34 10 19.40±1.10 27.90±2.20 34.50±3.40 15.10±3.30 2.24±0.36 1.00 3.51±0.32 0.93阴性对照 - 10 20.00±1.60 27.50±2.10 34.90±2.70 14.90±3.00 2.28±0.52 - 3.60±0.37 -

2.1.2 大豆异黄酮复合软胶囊对细胞免疫和体液免疫功能影响

以DTH和ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化能力试验为指标，评价大豆异黄酮复合软胶囊对细胞免疫功能的影响；以PFC和血清溶血素水平为指标评估大豆异黄酮复合软胶囊对体液免疫功能的影响，结果如图1所示。如图1a所示，高剂量组SRBC诱导DTH左后足跖厚度差为0.79 mm，相对于对照组，提升了34.87%，提升效果显著（p＜0.05）。如图1b所示，高剂量组的淋巴细胞增殖 OD差达到 0.17，相对于对照组，增长了36.07%，增长效果显著（p＜0.05）。说明大豆异黄酮复合软胶囊可以显著诱发DTH、提高小鼠脾淋巴细胞转化能力，增强小鼠细胞免疫功能，结果与郭智慧[16]的研究结果一致。如图1c所示，与阴性对照组相比，高剂量组溶血空斑数显著增长（p＜0.05），增长效果为 15.85%。如图1d所示，相对于阴性对照组，中剂量组小鼠的血清溶血素水平有显著提升（p＜0.05），高剂量组有极显著提升（p＜0.01），提升效果分别为9.98%、12.66%。表明大豆异黄酮复合软胶囊能显著增加小鼠PFC数量、提高小鼠血清溶血素水平，增强小鼠体液免疫功能。

2.1.3 大豆异黄酮复合软胶囊对小鼠单核-巨噬细胞功能和NK细胞活性的影响

碳廓清试验、受试物腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验和NK细胞活性试验的结果如表2所示。巨噬细胞和NK细胞均是非特异性免疫细胞，前者主要发挥吞噬作用，后者直接杀伤靶细胞，因此前者的吞噬能力及后者的活性可以评价机体的免疫功能[16，26，27]。由表2可见，相较于与阴性对照组，各剂量组小鼠的吞噬指数、鸡红细胞吞噬率及吞噬指数有一定程度的提升，但提升效果无统计学意义（p＞0.05）。说明大豆异黄酮复合软胶囊不能显著提高小鼠的碳廓清能力，无法增强小鼠的巨噬细胞吞噬功能。各剂量组小鼠 NK细胞活性与阴性对照组相比较，均无显著差异（p＞0.05）。表明大豆异黄酮复合软胶囊不能显著提高小鼠NK细胞活性。

表2 受试物对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能及NK细胞活性的影响Table 2 Effect of test substance on phagocytosis and NK cell activity of peritoneal macrophages in mice (±s)

表2 受试物对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能及NK细胞活性的影响Table 2 Effect of test substance on phagocytosis and NK cell activity of peritoneal macrophages in mice (±s)

组别 剂量/(g/kg·bw) 吞噬指数a p值 吞噬百率/% p值 吞噬指数b p值 NK细胞活性/% p值高剂量 1.00 5.60±1.02 0.56 34.10±6.20 0.70 0.82±0.08 0.59 30.49±7.61 0.86中剂量 0.67 5.48±1.11 0.76 33.80±5.30 0.78 0.82±0.70 0.53 30.30±5.98 0.90低剂量 0.34 5.29±0.95 0.97 33.70±3.80 0.81 0.80±0.07 0.84 30.80±6.61 0.80阴性对照 - 5.15±0.52 - 32.00±5.20 - 0.78±0.07 - 28.62±5.87 -

2.2 大豆异黄酮复合软胶囊安全性评价结果

2.2.1 大鼠急性毒性试验结果

大豆异黄酮复合软胶囊对大鼠急性毒性试验结果如表3所示。以19.76 g/kg·bw的剂量经口灌胃，14 d内，雌、雄大鼠体重均有所增长，未观察到急性中毒症状及死亡现象。解剖后，观察到小鼠肝、肾、脾、心、肺、胃、肠等主要脏器的均呈正常状态。表明大豆异黄酮复合软胶囊对大鼠急性毒性（MTD）大于19.76 g/kg·bw，参照急性毒性分级标准，急性毒性属于无毒性等级。

表3 大鼠急性毒性试验结果Table 3 Results of acute toxicity test in rats (±s)

表3 大鼠急性毒性试验结果Table 3 Results of acute toxicity test in rats (±s)

性别 动物数/只 剂量(MTD)/(g/kg·bw) 初始体重/g 第7 d体重/g 第14 d体重/g 出现中毒症状动物数/只 死亡数/只雌性 10 19.76 195.90±10.60 227.10±12.70 247.70±13.50 0 0雄性 10 19.76 199.20±10.80 242.10±13.90 272.70±15.00 0 0

2.2.2 遗传毒性试验

Ames试验结果如表4所示，大豆异黄酮复合软胶囊各剂量组在有、无S-9存在的条件下，回变菌落数均未超过自发回变菌落数的两倍，且无剂量-反应关系，表明大豆异黄酮复合软胶囊不会诱发菌株突变。

表4 Ames试验结果Table 4 Results of Ames test (±s)

表4 Ames试验结果Table 4 Results of Ames test (±s)

注：以上结果为3个平皿的均值±标准差。

剂量/(μg/皿) TA97 TA98-S-9 +S-9 -S-9 +S-9 5000 138.00±7.90 135.00±11.40 34.30±2.10 32.00±1.70 1000 134.30±10.10 135.00±9.80 36.70±2.50 35.30±1.50 200 137.70±9.00 137.70±11.20 35.00±3.60 36.30±1.50 40 137.00±10.80 135.00±8.00 35.30±3.50 34.70±2.50 8 139.30±8.60 135.30±9.00 34.30±2.50 36.00±3.00溶剂对照 135.30±9.10 138.70±11.00 34.70±2.10 34.30±3.10自发回变 134.30±8.60 142.00±7.90 36.00±2.00 37.30±1.50阳性照 2401.30±265.90 1758.70±143.40 1049.30±67.70 5588.00±330.60敌克松 2-AF 敌克松 2-AF 50.00 μg/皿 10.00 μg/皿 50.00 μg/皿 10.00 μg/皿剂量/(μg/皿) TA100 TA102-S-9 +S-9 -S-9 +S-9 5000 181.30±11.90 177.00±12.50 283.00±17.10 288.30±15.70 1000 188.70±11.00 183.70±13.70 281.70±16.000 285.70±15.40 200 182.30±14.20 191.70±13.70 276.3±12.70 276.30±17.80 40 186.30±12.10 179.30±13.80 291.00±16.70 286.30±16.10 8 190.00±12.10 182.70±11.00 289.70±12.30 286.70±17.60溶剂对照 179.00±14.20 186.30±14.40 285.70±16.00 288.30±13.70自发回变 180.00±13.70 181.30±11.00 286.70±15.30 283.70±17.20阳性照 2618.70±251.70 2678.70±221.60 833.30±66.30 909.30±86.20 NaN3 2-AF 敌克松 1，8-二羟基蒽酮1.50 μg/皿 10.00 μg/皿 50.00 μg/皿 50.00 μg/皿

小鼠骨髓细胞微核试验结果如表5所示，CP阳性对照组的微核率显著高于溶剂对照组（p＜0.01）；各剂量组微核率与溶剂对照组相比较，均无显著性差异（p＞0.05）；各剂量组的PCE/NCE值均在正常值范围内，且各剂量组PCE值占红细胞总数的比例均不少于溶剂对照组的20%。表明大豆异黄酮复合软胶囊对小鼠骨髓细胞没有致突变作用。

表5 小鼠骨髓细胞微核试验结果Table 5 Result of micronucleus test in mouse bone marrow cell (±s)

表5 小鼠骨髓细胞微核试验结果Table 5 Result of micronucleus test in mouse bone marrow cell (±s)

注：与溶剂对照组比较，**表示p＜0.01。

性别 剂量/(g/kg·bw) 检查PCE数/个 微核数/个 微核率/‰ (images/BZ_65_1640_393_1662_438.png±s) PCE/NCE 比值(images/BZ_65_1640_393_1662_438.png±s)雌10.0 5000 7 1.40±0.55 1000/926 1.08±0.07 5.0 5000 5 1.00±0.71 1000/928 1.08±0.08 2.5 5000 5 1.00±1.00 1000/919 1.09±0.06 0.0 5000 8 1.60±0.55 1000/918 1.10±0.09 CP(40 mg/kg·bw) 5000 108 21.60±2.61** 1000/1041 0.96±0.03雄10.0 5000 6 1.20±0.84 1000/930 1.08±0.04 5.0 5000 8 1.60±0.89 1000/938 1.07±0.08 2.5 5000 6 1.20±1.10 1000/926 1.09±0.09 0.0 5000 7 1.40±1.14 1000/929 1.08±0.07 CP(40 mg/kg·bw) 5000 112 22.40±2.70** 1000/1036 0.97±0.03

小鼠精子畸形试验如表6所示，CP阳性对照组精子畸形率极显著高于溶剂对照组（p＜0.01），各剂量组小鼠的精子畸形率与溶剂对照组比较，均无显著性差异（p＞0.05）。实验中的精子畸形主要表现类型为无钩、香蕉形、无定形。表明大豆异黄酮复合软胶囊对小鼠精子无致畸性作用。

表6 小鼠精子畸形试验结果Table 6 Results of sperm malformation test in mice (±s)

表6 小鼠精子畸形试验结果Table 6 Results of sperm malformation test in mice (±s)

注：与溶剂对照组比较，**表示p＜0.01。

剂量/(g/kg·bw) 动物数/只受检精子数/条精子畸形类型 精子畸形数/条精子畸形率/%(images/BZ_65_1640_393_1662_438.png±s)无钩 香蕉形 无定形 胖头 尾折叠 双头 双尾10.0 10 10000 19 21 118 5 0 0 0 163 1.63±0.32 5.0 10 10000 17 24 112 7 0 0 0 160 1.60±0.27 2.5 10 10000 17 23 109 5 0 0 0 154 1.54±0.23 0.0 10 10000 15 23 121 6 1 0 0 166 1.66±0.31 CP/(40 mg/kg·bw) 10 10000 64 107 375 47 3 0 2 598 5.98±0.66**

此外，30 d试验期间，大鼠生长情况良好，与溶剂对照组比较，各剂量组的体重、进食量、食物利用率、血液学指标、血液生化学指标的变化均无统计学意义（p＞0.05）；解剖观察和组织病理学检查也并未发现异常。在试验剂量下，大豆异黄酮复合软胶囊对大鼠各项观测指标未产生可见毒副作用，未观察到有害作用剂量（NOAEL）大于3.33 g/kg·bw。

3 结论

3.1 本研究对大豆异黄酮复合软胶囊的免疫功能进行了评价。结果显示，与对照组相比，高剂量组增强DTH能力、小鼠脾淋巴细胞转化能力的效果分别为34.87%（p＜0.05）、36.07%（p＜0.05），说明大豆异黄酮复合软胶囊具有提升细胞免疫的功能；高剂量组PFC 增值效果为 15.85%（p＜0.05），中、高剂量组分别提升小鼠血清溶血素水平9.98%（p＜0.05）、12.66%（p＜0.01），说明大豆异黄酮复合软胶囊具有提升体液免疫的功能。综上，大豆异黄酮复合软胶囊具有增强免疫功能的作用，这一结论为大豆异黄酮复合软胶囊在保健品方面的合理应用提供了理论支持。

3.2 对大豆异黄酮复合软胶囊的安全性进行了评价。大豆异黄酮复合软胶囊大鼠急性毒性MTD大于19.76 g/kg·bw，相当于人体推荐量的593.4倍，NOAEL大于3.33 g/kg·bw，属无毒级。Ames试验、小鼠骨髓细胞微核试验、小鼠精子畸形试验均为阴性，说明大豆异黄酮复合软胶囊无致突变和损害生殖系统作用。在本试验剂量范围内及相应环境条件下，大豆异黄酮复合软胶囊口服无明显毒副作用，食用安全性较高。