顾海龙，蔡迎春，杨智景，唐文乔，冯亚明

(1.江苏省农业科学院泰州农科所，江苏泰州 225300；2.上海海洋大学，水产种质资源发掘与利用省部共建教育部重点实验室，上海 201306)

长春鳊()隶属鲤科(Cyprinidae)鳊属()，俗称长身鳊、草鳊等，常见于中国各大水系,在长江主要分布于中下游干、支流及其附属湖泊，是长江中下游重要的经济鱼类和捕捞对象之一。与大多数鱼类一样，人工养殖的长春鳊无法自行繁殖，需注射外源性催产激素诱导其产卵，但亲鱼的应激反应较大。鱼类亲本因注射催产剂而产生强烈应激的现象在刀鲚()等其他鱼类的人工繁殖中也常有发生，但这一现象尚未得到很多学者的关注和研究。

下丘脑-垂体-肾间组织轴(HPI轴)是鱼类最重要的应激调控轴。机体受到应激后，下丘脑分泌促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)，刺激垂体分泌促肾上腺皮质激素(ACTH)，进而诱导肾上腺释放糖皮质激素和盐皮质激素。糖皮质激素主要为皮质醇，具有调节糖、蛋白质和脂肪代谢的功能，可影响葡萄糖的合成和利用、脂肪的动员及蛋白质的合成；盐皮质激素主要为醛固酮，直接参与肾脏调节水盐代谢，保钠排钾，维持血压平衡。催乳素是脊椎动物腺垂体分泌的单链多肽类激素，与促肾上腺皮质激素、生长激素并称为应激反应中腺垂体分泌的三大激素。本研究以雌性长春鳊为研究对象，分析亲本注射绒毛膜促性腺激素(HCG)、促黄体素释放激素类似物(LHRH-A)、马来地欧酮(DOM)及它们的混合制剂后，催乳素、皮质醇及总蛋白、血浆渗透压、血糖等血液生化指标的变化情况，探索亲鱼对不同催产激素的应激反应，为长春鳊人工催产技术的优化提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

实验地点位于江苏省靖江市滨江水产良种场人工繁殖车间，实验水温25～28 ℃，实验用水为曝气5 d以上的自来水，实验期间不投喂。亲鱼为该良种场自繁培育的长江第三代雌性2龄长春鳊，经抽样解剖，注射前卵巢均已发育至Ⅳ期末。亲鱼大小相近，体长(37.3±1.5) cm，体重(1 109.6±78.8) g。

1.2 实验设计

实验鱼按分组分别饲养于50 m的室内水泥池，每组设三个平行，每个平行有30尾实验鱼。对照组为注射催产激素前随机选择的9尾鱼。4个处理组按照常规生产中使用的催产剂和注射剂量，处理组在水体中分别快速注射(1)HCG：500 IU/kg；(2)DOM：2.5 mg/kg；(3)LHRH-A：5 μg/kg；(4)HCG+DOM+LHRH-A=(500 IU+2.5 mg+5 μg)/kg(下称混合组“ALL”)。催产剂购自宁波第二激素厂，注射液用0.75%的生理盐水配制。分别在激素注射后的0.5 h(注射初期)、8 h(效应初期)、14 h(效应末期)、20 h(产后恢复期)取样，每个实验池随机取实验鱼3尾，称量体长、体重等基础数据后，尾静脉取血。同一个实验池的3尾鱼血液合并为一个样，血液置于2 mL离心管中，柠檬酸葡萄糖(ACD)抗凝，静置30 min后，4 ℃、5 000 r/min离心10 min，所得血浆置于-20 ℃冻存待测。

1.3 样品测定

皮质醇、雌二醇、催乳素使用放射免疫法检测(西安核仪器厂，XH6080)，其标准品及样本(100 μL)加标记物抗体后，37 ℃分别温育45 min(皮质醇)、2 h(雌二醇)、20 h(催乳素)，加分离剂15 min，3 800 r/min离心15 min，绘制标准曲线，依据曲线计算待测物浓度。血糖(葡萄糖氧化酶法)、总蛋白(双缩脲法)、甘油三酯(GPO-PAP法)、谷丙转氨酶(丙氨酸底物法)、谷草转氨酶(天门冬氨酸底物法)、乳酸(比色法)、K(四苯硼钠比浊法)、Na(焦锑酸钾比浊法)、Cl(硫氰酸汞法)均使用东芝120全自动生化分析仪检测。血浆渗透压使用雅培干式便携式血气分析仪i-stat300G检测，先测血气HCO，后用Cl联合检测渗透压。

1.4 数据处理

采用SPASS 25.0软件进行One-way ANOVA单因素方差分析；Qiime 2软件进行主成分(PCA)分析。

2 结果

2.1 不同催产激素对长春鳊催乳素和雌二醇的影响

注射催产剂后长春鳊血液中催乳素和17 β-雌二醇水平的变化见表1和图1。整体上，注射催产剂使催乳素水平降低(如图1-a)，雌二醇水平升高(如图1-b)。注射后0.5 h和8 h，LHRH-A组及混合组催乳素水平显著低于对照组；注射后14 h，除混合组外，其余组催乳素水平均显著低于对照组，注射后20 h，所有组催乳素水平均显著低于对照组。LHRH-A组雌二醇水平在注射后8 h达到峰值[(481.05±103.73) pg/mL]，且显著高于对照组和其他三组，说明LHRH-A效应时间最短。混合组雌二醇水平在注射后14 h达到峰值[(258.19±33.78) pg/mL]，注射后20 h，所有组雌二醇水平回落至相似水平，但均显著高于对照组，说明所有催产剂均能有效诱导卵子成熟。

表1 注射催产剂后长春鳊血液中催乳素和17 β-雌二醇水平的变化

图1 注射催产剂后催乳素(PRL)、雌二醇(E2)水平的变化情况

2.2 不同催产激素对长春鳊皮质醇及代谢的影响

注射催产剂后长春鳊皮质醇和血糖、乳酸、TP、ALT、AST含量变化情况列入表2和图2。由图2-a可知，皮质醇水平在注射后8 h和20 h时各组差异较大。混合组的皮质醇水平在注射后8 h后上升至峰值[(881.56±11.85) ng/mL]，此后一直高于其余三组；HCG组皮质醇水平注射后20 h显著上升至峰值[(743.16±94.79) ng/mL]；LHRH-A组则在此时显著降低至(281.86±27.27) ng/mL。皮质醇和血糖是指示应激的重要指标，且糖皮质醇具有加速糖类和脂类代谢的作用。HCG组与DOM组的皮质醇和血糖变化比较一致，两组的血糖在0.5 h时显著上升(图2-b)；甘油三酯的含量在0.5 h和20 h差异较大，0.5 h时除混合组外，其余三组均显著升高；混合组自8 h开始显著高于对照组，20 h达到峰值[(5.80±0.17) mmol/L]，预示着机体在短时间内受到了较强烈的应激。LHRH-A组乳酸含量在0.5 h时降低，8 h时有所回升，其余组在0.5 h升高后一直降低。各组总蛋白的含量在14 h和20 h差异较大，总体趋势先降后升；HCG组在14 h达到峰值[(49.0±7.85) g/L]，混合组在20 h达到峰值[(48.5±1.65)g/L]。谷丙转氨酶(图2-e)和谷草转氨酶(图2-f)是表征肝生理功能的指标，混合组谷丙转氨酶0.5 h达到峰值[(11±2.1) IU/L]，此后回落，谷草转氨酶0.5 h后持续上升，14 h达到峰值[(227±41.5) IU/L]后略有回落；HCG组的谷丙转氨酶和谷草转氨酶在20 h时均显著升高。

表2 长春鳊注射催产剂后皮质醇及血液指标的变化

图2 皮质醇(COR)、血糖(Glu)、乳酸(lactic acid)、总蛋白(TP)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、甘油三酯(TG)含量的变化情况

2.3 不同催产激素对长春鳊血浆渗透压及K+、Na+、Cl-的影响

注射催产剂后长春鳊血浆渗透压、K、Na、Cl含量数据及变化情况见表3和图3。混合组的血浆渗透压8 h后显著低于对照组，其余组均先上升后下降。混合组的K持续降低，14 h时达到最低[(4.35±0.50) mmol/L]，此后回升；HCG组在0.5 h时达到最低，此后回升，其余组呈现降-升-降-升的波动变化。在Na上，混合组与DOM组整体持续上升，其余两组在14 h时达到峰值后回落。混合组的Cl含量波动较大，其余组在0.5 h显著升高后，逐步降至对照组水平。盐皮质醇具有调控肾脏的渗透压和离子交换的功能，从图3可以看出，亲本在注射催产剂后，盐皮质醇也发生了明显的变化。

表3 长春鳊注射催产剂后血浆渗透压、K+、Na+、Cl-含量的变化

图3 血浆渗透压(osmotic pressure)、K+、Na+、Cl-含量的变化情况

2.4 主成分分析

对不同时间点测得的13个指标进行主成分分析，并根据第一、二主成分的各因子得分绘图(图4)。结果表明，按累计贡献率接近85%计，注射后0.5h，得到五个主成分，贡献率分别为30.42%、20.62%、14.44%、11.17%及8.69%，累计贡献率达85.34%；第一主成分的主要差异指标为E(载荷值0.411)、ALT(载荷值-0.345)、TG(载荷值0.361)、Na(载荷值0.340)、Cl(载荷值0.383)、OP(载荷值0.398)，显示了不同的催产激素对促进卵子发育和各试验组在抗应激上的差异。注射后8h，得到四个主成分，贡献率分别为48.34%、18.51%、14.46%及8.61%，累计贡献率达89.92%；第一主成分的主要差异指标为COR(载荷值-0.344)、AST(载荷值-0.345)、Na(载荷值-0.366)、Cl(载荷值0.390)、OP(载荷值0.392)，显示了注射后8 h，各试验组在应激上的差异。注射后14 h，得到四个主成分，贡献率分别为29.60%、27.56%、15.05%及10.20%，累计贡献率达82.41%；第一主成分的主要差异指标为TP(载荷值0.445)、GLU(载荷值0.396)、K(载荷值0.391)、Cl(载荷值0.436)，显示了各试验组在应对胁迫能力上的差异。注射后20 h，得到四个主成分，贡献率分别为47.70%、19.35%、11.07%及8.00%，累计贡献率达86.12%；第一主成分的主要差异指标为COR(载荷值0.332)、PRL(载荷值0.311)、AST(载荷值0.344)、TP(载荷值0.367)、Na(载荷值0.308)，这些指标主要表征机体的应激状态和肝肾组织的异常。

图4 13个指标的主成分分析Fig.4 Principal component analysis of the 13 indicatorsA：LHRH-A2组，D：DOM组，H：HCG组，W：混合组。

3 讨论

3.1 长春鳊的诱导产卵

鱼类性腺发育是GtH缓慢而稳定增加的结果，参与GtH分泌活动调节的神经激素有很多，在鲤科鱼类上，起主要作用的是GnRH和多巴胺。GtH分泌活动受到GnRH刺激和多巴胺抑制的双重调节，并且多巴胺既直接抑制GnRH和GtH的释放，也抑制GnRH刺激GtH释放的作用。HCG、DOM及LHRH-A是鲤形目鱼类人工繁殖中较为常用的催产剂，不同的鱼类适应不同的催产剂，且一些鱼类需要几种催产剂混合使用才能成功催产。与团头鲂等其他鱼类的诱导产卵不同，长春鳊的人工催产剂使用HCG+DOM+LHRH-A联用效果最好，但亲鱼的应激反应较大。

雌二醇(E)是卵子发育和成熟过程中的重要效应分子。研究表明，性腺发育至成熟过程中，E含量逐渐上升至高峰，排卵前则降低。高水平的E可以促进卵子的发育，但会抑制排卵。本研究中，LHRH-A组在8 h时上升至对照组的23倍，混合组在14 h时上升至对照组的11倍，此后迅速回落；其余两组变化不显著。这与实际生产中，只有混合组和单独注射LHRH-A组能有效诱导性腺成熟并排卵是一致的，但LHRH-A组过高的E可能是导致最终产卵率很低的重要原因。催乳素(PRL)能刺激卵泡促黄体激素(LH)受体的生成，后者能直接促进生殖细胞成熟。PRL作为一种垂体前叶激素，其分泌受下丘脑催乳素释放抑制因子和催乳素释放因子的双重调节，任何干扰下丘脑多巴胺合成、多巴胺向垂体的运送等过程的作用，均可引起抑制性调节的减弱而使得PRL水平的升高。DOM组在注射后0.5 h，PRL水平上升。因为DOM不仅阻断了多巴胺对GnRH的抑制作用，也阻断了多巴胺对催乳素释放的抑制作用，使得DOM组的催乳素水平升高；HCG组催乳素水平在0.5 h没有明显变化，说明HCG对长春鳊的诱导产卵作用没有明显效果；LHRH-A组和混合组在0.5 h催乳素水平明显降低，这可能是他们对长春鳊的脑垂体产生了较大的刺激。因为脑垂体受刺激造成机能减退后，会降低催乳素的水平。14 h时，混合组和LHRH-A组催乳素回升，说明了这两组催产剂发挥了诱导产卵的作用。20 h时，LHRH-A组的催乳素水平降低至最低值，说明效应时间已过。

3.2 长春鳊对不同催产激素的应激反应

在长春鳊的人工繁殖过程中，注射操作等其他行为也可能会对其造成一定的刺激，但主成分分析结果表明，注射后同一实验组相同时间点的差异指标近似，而不同时间点的差异指标则不同，这说明，各组应激生理指标的变化确由不同的催产剂造成，实验结果存在一定的参考意义。

HCG组的血糖、总蛋白、乳酸、甘油三酯均在短期内显著升高，说明HCG的注射对长春鳊造成了刺激。皮质醇和AST在20 h时达到最高值，与混合组相当，血浆渗透压也在20 h降至与混合组相当的水平，这可能都说明了混合组中的主要应激反应都与HCG联系更紧密。GtH是高度种族特异性的，源自人体的HCG可能并不完全适用于长春鳊。DOM组的皮质醇、ALT、AST及血浆渗透压变化不显著，说明应激反应不强烈，肝肾的生理功能没有受到影响。血糖的升高与TP的降低可能是为了应对外源刺激，通过糖异生途径生成了大量的血糖用于能量的补充。所以，DOM的注射虽引起长春鳊一定的应激反应，但影响不大。LHRH-A组皮质醇在20 h显著降低，说明了机体应对刺激的能力减弱，这可能是脑垂体受到过度刺激而出现紊乱的结果。因为LHRH-A组在8 h时，E增加至对照组的23倍，但并不能自行产卵。而ALT、AST及血浆渗透压等其他所有指标都相对稳定，说明了肝肾的生理功能正常。混合组的皮质醇水平在注射后8 h显著高于对照组，且此后维持在较高水平，说明混合催产激素的注射对长春鳊造成了较大的刺激，而较高的ALT、乳酸,随后较高的AST以及较低的TP和TG水平都表明这一刺激可能对肝的生理功能造成了较大的影响。虽然血糖较为稳定，后期乳酸回到正常水平，且TP、TG都显著高于对照组，说明糖类、脂类及蛋白的代谢得到了一定程度的恢复，但较高的AST说明这种恢复并不完全。同时，较低的血压以及剧烈变化的K、Na、Cl也说明了应激可能对肾的生理功能造成了一定的影响。在鱼类体内，肝脏在消化、代谢、排泄、蛋白质生物合成、内分泌功能、能量储存、激素清除、应激和免疫反应等各种生理过程中发挥着重要作用，这些特征使得肝脏成为研究鱼类健康状况的主要器官。

综上所述，在三种激素中，DOM的刺激不强烈；HCG对长春鳊的刺激较大，可能对肝肾的生理功能造成一定的影响；LHRH-A对脑垂体的刺激比较强烈，会降低长春鳊对抗外界刺激的能力。因此，长春鳊人工繁殖中，亲鱼强烈的应激反应确实与催产剂的使用息息相关。所以，长春鳊的催产剂在组合和剂量上应该适当调整。根据本实验结果，建议适当降低HCG的比例，同时应注重对产后亲鱼的护理，减少其应激。