高 娜，杨 坤，方 婷，梁阳阳，崔 凯，卢文轩

(安徽省农业科学院水产研究所水产增养殖安徽省重点实验室，合肥 230000)

随着长江流域重点水域全面禁捕方案的实施，重点湖泊、水库等大型水域退出渔业生产功能，渔业生产空间大幅压缩，池塘水域成为渔业发展的主战场。与此同时，水产养殖业的绿色发展对池塘养殖环境治理提出了更高要求。研发经济高效的养殖废水处理工艺成为养殖企业和环保行业的热点问题。目前已开发出包括活性污泥法、生物接触氧化法、序批式反应器(SBR)，移动床生物膜反应器(MBBR)等多种处理工艺。微生物是污水处理系统中污染物去除的主体，系统的稳定运行和处理效果与其中的微生物群落结构及功能密切相关。因此，研究养殖废水处理系统中各模块的微生物群落组成、明确占主导地位的微生物群落以及微生物群落与污染物浓度之间的关联性,对优化废水处理系统的菌群结构，提高水质净化效率具有重要作用。

污水生物处理系统的性能和稳定性与微生物群落结构和动态密切相关。为了解废水处理系统中各单元的净水机制，掌握优化系统运行参数的基础数据，为养殖废水高效净化提供一定的技术支持，本研究运用高通量测序技术对采用水解酸化+A/O工艺的龟鳖废水处理系统中的微生物群落结构进行分析，通过相关性分析对环境因子和微生物群落的变化进行分析，探索对污染物质降解起重要作用的功能微生物。

1 材料与方法

1.1 龟鳖养殖废水处理工艺流程

选择安徽省铜陵市顺东农业科技有限公司龟鳖产业园为研究对象，主养品种中华鳖，饵料为机制饲料(主要成分为40%粗蛋白、4.5%粗脂肪、12%水分、粗纤维5%、粗灰分16%)结合植物性蛋白(胡萝卜、番茄等)，日常养殖过程中池水不外排，仅在商品鳖出售时才清池排水。龟鳖废水处理工艺流程见图1，养殖周期结束后，集中排放的养殖尾水经过人工格栅拦截掉废水中的大颗粒物，进入水解酸化池，使大分子难降解的物质分解为小分子易降解物质。出水进入厌氧池进一步水解酸化去除化学需氧量(COD)。厌氧发酵后的废水进入好氧池，通过不断地曝气使微生物进行有氧呼吸从而去除其中的污染物。经过曝气处理的污水依次通过初沉池和二沉池，最后进入生态湿地进行深度净化，最终出水达标排放。

图1 龟鳖养殖废水处理工艺流程

1.2 水样采集

依据系统的运行情况，于2020年4月14日进行样品采集，共采集18个水样，其中在龟鳖养殖温室(WS)、水解酸化池(CC)、厌氧池(YY)、好氧池(HY)、初沉池(CS)、二沉池(SC)各取3个重复样。每个点取500 mL废水装入无菌PV瓶，低温条件下保存运输至实验室进行后续分析。

1.3 水质检测

1.4 微生物菌群分析

各样点采集的水样经0.22 μm的微孔滤膜过滤，将富集了微生物菌体的滤膜送至美吉生物医药科技有限公司完成DNA提取，PCR扩增，文库构建，上机测序，高通量数据处理等工作。

1.5 数据统计分析

运用EXCEL软件统计平均数和标准方差，使用UPARSE软件，根据97%的相似度对序列进行OTU聚类，并在聚类的过程中去除单序列和嵌合体。利用RDP对每条序列进行物种分类注释，利用QIIME软件计算样品包括Chao1指数和Shannon指数的Alpha多样性值。运用person相关系数计算物种与环境因子之间的相关性。

2 结果

2.1 水体理化性质

表1 各处理单元水质指标分析

2.2 样品的OTUs和多样性分析

表2显示所有样本的覆盖度均高于99%，表明测序结果覆盖度较好且具有很高的可信度，能够代表样本的真实情况。对所有样品的有效序列进行聚类，以97%的相似性将序列聚类成一个OTU。维恩图可以比较直观地表现样品中的OTU数目组成相似性及重叠情况，18个样品中共有的OTU数目为111，不同样品中特有OTU表现为养殖温室295个、水解酸化池116个、厌氧池78个、好氧池46个、初沉池20个、二沉池27个(图2)。α多样性分析结果显示(表2)，不同处理单元废水中的微生物群落的丰富度指数(ACE和Chao l)和多样性指数(Shannon和Simpson)均存在一定的差异。

图2 OTUs韦恩图

表2 微生物群落多样性指数

2.3 不同处理单元水体中细菌群落结构特征与动态变化

各单元水体中共检测到42个门水平的细菌和一些无法归类的细菌，所有样本中丰度占比均小于0.05的物种归为others(图3)。由表2可知，养殖温室水体中微生物多样性水平较高，图3显示其中各类微生物占比较为平均。水解酸化池水体中优势类群为变形菌门、拟杆菌门和厚壁菌门，占比率为49.56%、27.25%、5.88%。厌氧池中优势类群发生了变化，主要为放线菌门(42.56%)、变形菌门(41.02%)和拟杆菌门(7.06%)。好氧池相对于厌氧池来说，优势群体的种类没有改变，除变形菌门(42.18%)外，其他种群数量明显发生了变化，拟杆菌门(22.43%)显著高于厌氧池，放线菌门(20.63%)显著低于厌氧池。初沉池和二沉池中优势类群依然为变形菌门、拟杆菌门和放线菌门，但是种群含量存在差异，二沉池中变形菌门处于绝对优势地位，占比高达56.55%。

图3 不同处理单元水体中细菌群落结构组成(门水平)

以属为分类单元分析水体中的细菌群落结构，结果如图4所示，龟鳖废水处理系统中检测到的细菌覆盖了679个属，大量的序列不能归入已知属(数据库分别以科的名称加-norank，-unclassified来表示)，所有样本中丰度占比均小于0.05的物种归为others。水体中细菌类群和含量随着处理进程逐步发生改变。养殖温室中细菌多样性水平最高，但是丰度占比低于0.05的物种比例高达72.83%，其他优势细菌属为5.96%，分枝杆菌属7.36%，norank-f-norank-o-Saccharimonadales 6.82%。在水解酸化池中，优势细菌属为噬氢菌属35.62%，黄杆菌属17.09%，地杆菌属2.8%。进入厌氧池，优势细菌属发生了变化，变为尚未分类的微杆菌科(unclassified-f-Microbacteriaceae)18.77%，气单胞菌属14.87%，hgc1-clade 6.43%。好氧池中优势细菌属为肠杆菌属14.67%，黄杆菌属7.96%，hgc1-clade 6.43%；进入初沉池优势细菌属变为12.94%，不动杆菌属8.91%，黄杆菌属8.60%；二沉池优势细菌属为产卟啉杆菌属13.99%，10.74%，尚未分类的红杆菌科(unclassified-f-Rhodobacteraceae)9.71%。

图4 不同处理单元水体中细菌群落结构组成(属水平)

2.4 水质对龟鳖废水处理系统中细菌群落结构的影响

表3 属分类水平上细菌菌群与水质因子的相关性分析(分类水平总丰度前10的物种)

3 讨论

有研究表明温室龟鳖养殖在水产养殖模式中产生的污染最大，对环境的污染最严重，因此研究龟鳖养殖废水处理工艺十分迫切。特定的微生物菌群能够促进废水处理系统中某些复杂大分子有机化合物的降解。本实验龟鳖废水处理系统采用水解酸化+A/O的工艺流程，温室外排的废水通过不同类型的功能池分级处理,不同类型功能池中微生物群落分布具有较大差异。多样性分析结果中显示好氧阶段的细菌丰富度和群落多样性比厌氧处理单元高，研究表明细菌丰富度和群落多样性越高，污染物的去除效果越好。废水经好氧单元处理后，细菌丰富度和多样性明显减少，可能是由于好氧阶段消耗了废水中大部分的营养物质，使得下游处理单元中的微生物生长受限。

大量关于污水处理系统中微生物的研究表明在不同的污水处理系统中的细菌群落主要以变形菌、绿弯菌、放线菌、厚壁菌和拟杆菌为功能菌群。在本研究中，变形菌门在各处理单元中都占有很大比例，研究表明变形菌门大部分属于异养型细菌，是COD降解和脱氮过程的主要贡献者，其中的β-变形菌纲更是与反硝化作用密切相关，拟杆菌门在污水处理中的作用仅次于变形菌门，研究资料表明该菌门有利于促进含氮物质的利用、类固醇生物转化及水解大分子物质。以上分析表明，不同处理单元水体中优势类群种类和含量均存在一定差异，这与翟一帆等在利用A2/O工艺处理养猪废水中的研究一致。以属分类水平讨论处理系统中微生物群落组成发现，优势细菌属为黄杆菌属、噬氢菌属、尚未分类的微杆菌科、等。其中噬氢菌属和黄杆菌属是典型的反硝化菌属，参与水体脱氮，也是城市污水及工业废水处理活性污泥中优势菌群。也与氮循环相关，可以使有机氮转变成无机氮如硝酸盐氮等。每一级处理单元中均有很多尚未得到分类鉴定的物种，有研究指出这些未分类或不能培养的功能性菌群的生长在维持水体氮平衡中起着至关重要的作用。综上，在门和属水平对微生物群落组成的研究发现不同的废水处理阶段优势菌属不尽相同，细菌群落在二沉池出水和温室进水中存在明显差异。在水解酸化池、厌氧池及好氧池样品中存在大量特殊功能菌群，它们在该龟鳖废水处理系统中，对污染物的分解和氮磷的去除发挥着重要作用。

4 结论

本研究采用高通量测序技术解析龟鳖废水处理系统各处理单元的细菌群落结构，共检测到42个细菌门，679个细菌属。温室中的优势细菌和分枝杆菌属是典型的致病菌，经过生物处理后，二沉池出水中致病菌显著减量。黄杆菌属、肠杆菌属和气单胞菌属是常见的鱼类致病菌，在前期处理进程中这些细菌占有一定的优势地位，经过一系列生物处理进入二沉池后，它们的相对丰度大幅度下降，不影响废水作为再生资源进入养殖池塘重新利用。各处理单元水质分析也表明，废水经系统处理后符合污水综合排放一级A标准(GB8978-1996)。综上，采用水解酸化+A/O工艺处理可实现龟鳖养殖废水的高效净化和循环利用。该工艺相比于生态塘和人工湿地净化既能减少用地，又能降低造价和运行费用，符合资源节约型、环境友好型社会的发展要求，对生物法处理规模化养殖废水有一定的理论参考价值。