闫 戈，顾 晨,3，王承鑫，李世平，魏万红,2,3

(1.扬州大学生物科学与技术学院行为生态学实验室，江苏扬州225009；2.扬州大学江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州225009；3.扬州大学动物科学技术学院，江苏扬州225009)

克氏原螯虾()属于甲壳纲十足目，是世界淡水螯虾最重要的养殖品种，占螯虾总产量的70%～80%。随着人工农业区的迅速扩大，因养殖过程中缺乏科学管理经验、疏于病害防治等经常会造成克氏原螯虾病害频繁发生，其中副溶血弧菌()、弗氏柠檬酸杆菌()、嗜水气单胞菌()和鳗鲡爱德华氏菌()是重要的病原菌。目前，水产养殖业中主要使用抗生素控制这些病害的暴发，但抗生素的滥用往往会导致动物病原体耐药性增强、药品残留过高、水体污染等问题，严重阻碍克氏原螯虾养殖行业的可持续发展，因此寻找一种安全高效的抗生素替代品成为水产养殖业的研究热点。

众多的研究表明，药用植物作为免疫增强剂能增加宿主免疫系统的抗菌、抗病毒作用，草药、香料、海藻、草药提取化合物和植物衍生产品中含有酚类、多酚类、生物碱、醌类、萜类、凝集素和多肽化合物，它们中的许多成分是抗生素和其他合成化合物的有效替代品，可以作为益生元与其他免疫兴奋剂混合使用。芡实(，EF)属于睡莲科芡属，果实中含有丰富的淀粉、蛋白质、多种必需氨基酸和人体所需的矿物质元素,以及大量的多酚类、甾醇类及黄酮类等抗氧化性物质。研究发现，芡实壳乙醇提取物(EFSS)中的酚类化合物具有强抗氧化性、高自由基清除能力以及抑制脂质过氧化作用，它能够抑制痤疮丙酸杆菌()和表皮葡萄球菌()的生长，也对嗜水气单胞菌、温和气胞菌()等水生动物常见致病菌具有良好的抑菌性。但有关芡实是否能够提高水生动物的生长免疫的研究尚无报道。本研究通过对克氏原螯虾饲喂含有不同浓度芡实乙醇提取物饲料后，测定克氏原螯虾生长、免疫指标的变化，探讨芡实提取物作为一种新型的免疫增强剂来替代抗生素的可行性。

1 材料和方法

1.1 实验动物

将扬州里下河农科所养殖基地的克氏原螯虾带回扬州大学实验室，选取体格健壮、大小均一的虾，在模拟生态养殖系统中暂养一周后转移至16个水族箱中，每个水族箱投放平均规格为(13.6±2.7) g的健康克氏原螯虾20只，光照周期为12L∶12D，室温为(22±1) ℃，pH为7.0±1.2，溶解氧≥6.0 mg/L，24 h不间断供氧。

1.2 方法

1.2.1 芡实提取物的制备

实验植物芡实采自于高邮湖，阴干后于烘箱中50 ℃烘烤2～3 h，剪成小段，粉碎机打碎成粉末，于密封袋内密封保存。称取1 000 g植物粉末，按照1∶10的比例用乙醇浸泡24 h后抽滤，收集滤液，抽滤后的滤渣继续浸泡24 h后再抽滤，收集滤液，如此反复3～4次，最后合并滤液。利用旋转蒸发仪减压浓缩至粘稠状，烘干备用。

1.2.2 实验饲料的制备

实验所用基础饲料为新乡市华畜商贸有限公司生产的龙虾饲料，其营养成分为：粗蛋白质28%，粗脂肪3%，粗纤维8%，总磷1.2%，粗灰分18%，赖氨酸1.5%～3%，水分12%。将芡实乙醇提取物按照0、5、10、20 g/kg添加到磨成粉末的成品饲料中，充分搅拌均匀后采用饲料制粒机加工成粒径为2.0 mm的沉水性饲料。

1.2.3 养殖实验

养殖实验按照饲喂饲料芡实提取物的添加浓度分为对照组(0 g/kg，A组)、0.5%芡实组(5 g/kg，B组)、1%芡实组(10 g/kg，C组)和2%芡实组(20 g/kg，D组)。每组4个水族箱，每个水族箱20只克氏原螯虾。根据实验分组投喂相应的饲料，每天投饲量为克氏原螯虾体重的3%～5%，可根据生长情况适当调整，以2 h内吃完为宜。每天投喂两次，上、下午各一次，每次饲喂前都要清除残饵和粪便。养殖周期为28 d。养殖实验开始前和结束后，对各组克氏原螯虾称重，并计算增重率(WGR，%)和特定生长率(SGR，%/d)。计算公式如下：

=100%×(-)；

=100%×(ln-ln)；

式中：为第天末均重，为第0天初始均重，为实验天数。

1.2.4 攻毒实验

攻毒实验使用的嗜水气单胞菌是由江苏省淡水水产研究所提供，参考Jiang等的实验方法计算该菌株24 h内克氏原螯虾半致死菌液浓度为2.4×10CFU/mL。在养殖28 d后，每个处理组随机选取20只克氏原螯虾进行攻毒，分别用一次性注射器在克氏原螯虾的第三腹节基部注射2.4×10CFU/mL嗜水气单胞菌菌液0.1 mL，然后放入缸中继续饲养，攻毒后不再投喂饲料，每隔12 h观察记录死亡结果，持续3 d后计算攻毒后的存活率。

1.2.5 养殖实验样品采集

饲喂28 d后，各组克氏原螯虾禁食24 h，从每个处理组中随机抽取10只克氏原螯虾用冰包埋10 min，保持低温麻醉。用1 mL注射器从围心腔抽取血淋巴，采集之后用4 ℃离心机离心(5 000 r/min)10 min，取上清液(血清)，-20 ℃冻存备用。然后在无菌条件下摘取肝胰腺，不同样本在取样间隔用75%酒精擦拭取样器具。

1.2.6 血清、肝胰腺中免疫相关酶活的测定

采用南京建成生物工程研究所的试剂盒进行血清超氧化物歧化酶(SOD)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)和肝胰腺中SOD、过氧化氢酶(CAT)的测定，总蛋白的测定采用丙烯酸丁酯(BCA)法。血清中PO酶活的测定参考Ye等的实验方法，通过监测L-3，4-二羟基苯丙氨酸的多巴胺能生成速率，用分光光度法测量酚氧化酶(PO)活性。为了确保吸光度在0.1～1.0，将3 mL磷酸盐缓冲溶液(0.1 mol/L，pH6.0)，100 μL L-DOPA(0.01 mol/L)和100 μL血清完全混合，于25 ℃水浴中静置10 min，在490 nm波长下每隔2 min测定10 min的光密度(OD)。一个酶活力单位定义为每毫升血清每分钟增加0.001吸光度。

1.2.7 免疫相关基因的表达

通过实时荧光定量PCR检测亲环素A基因()、肽过氧化物酶基因()、抗菌肽基因()和18S rRNA在克氏原螯虾肝胰腺组织中的表达情况。引物由上海生物工程公司合成(表1)，目的片段在100～200 bp。使用RNAiso Plus试剂从虾的肝胰腺组织中提取总RNA，随后采用1.5%琼脂糖凝胶电泳和显微分光光度法测定RNA质量，选择/稳定在1.9～2.0的RNA，用0.1%DEPC将RNA浓度调整至(1 000±100) μg/μL备用。使用HiScript RT Super Mix试剂盒(南京Vazyme有限公司，中国)逆转录生成cDNA。使用SYBR Green I荧光试剂盒(南京Vazyme有限公司，中国)通过real-time PCR(Applied Biosystems 7300 real-time PCR System，USA)检测mRNA表达水平，反应体系20.0 μL：10 μL 2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix，0.4 μL Primer F(10 μmol/L)，0.4 μL Primer R(10 μmol/L)，1 μL cDNA，8.2 μL ddHO。

表1 目的基因CypA、GPxs、Astacidin和内参基因18S rRNA的引物序列Tab.1 Primer sequence of target gene CypA、GPxs、Astacidin and housekeeping gene 18S rRNA

将96孔板在大型冷冻离心机上1 000 r/min(4 ℃)离心1 min后，放入RT-qPCR(7500)仪器进行反应，程序设置为：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40个循环，每个样品3个平行。

本实验采用2-ΔΔ法测定克氏原螯虾免疫相关基因mRNA的表达量，设为对照组样品管家基因的值，为对照组样品目的基因的值；为处理组样品管家基因的值，为处理组样品目的基因的值。则处理组和对照组基因表达水平的比值可用公式2-ΔΔ进行计算：

ΔΔ=(-)-(-)，目的基因的相对表达量=2-ΔΔ。

1.2.8 数据处理

数据采用SPSS 20.0软件的单因素方差分析(One-way ANOVA)进行统计，采用邓肯氏法进行多重比较，差异水平为(<0.05)。数据以平均值±标准误(Mean±SEM)的形式表示。

2 结果和分析

2.1 芡实提取物对克氏原螯虾生长发育的影响

表2结果显示，与对照组相比，0.5%芡实提取物处理组克氏原螯虾的生长速度较快，而1%和2%芡实提取物组生长速度较慢；各实验组的克氏原螯虾终末质量、增重率、特定生长率不存在显著性差异。

表2 芡实提取物对克氏原螯虾生长性能的影响Tab.2 Effects of EF extracts on growth performance of P.clarkii

2.2 芡实提取物对克氏原螯虾抗氧化酶及免疫相关酶活性的影响

表3可知，2%芡实组血清中的SOD活性显著高于对照组，0.5%芡实组血清中的ACP和AKP活性显著高于对照组，而1%芡实组和2%芡实组血清中的ACP活性显著低于对照组。血清中的PO活性在不同处理组间没有显著差异。表4可知，0.5%芡实组的肝胰腺中的ACP活性显著高于对照组，肝胰腺中的SOD、CAT、AKP的活性在不同处理组间均没有显著差异。

表3 各组克氏原螯虾的血清生化指标Tab.3 The values of the blood biochemical parameters in the P.clarkii in different treatments

表4 各组克氏原螯虾的肝胰腺生化指标Tab.4 The values of the hepatopancreas biochemical parameters in the P.clarkii in different treatments

2.3 芡实提取物对克氏原螯虾肝胰腺免疫基因表达的影响

图1可知，2%芡实组克氏原螯虾肝胰腺中mRNA的相对表达量显著高于对照组和1%芡实组，而0.5%芡实组和1%芡实组相对于对照组无显著差异。2%芡实组mRNA的相对表达量显著高于对照组，而0.5%芡实组和1%芡实组相对于对照组同样无显著差异。mRNA的相对表达量在各处理组之间均无显著差异，但各实验组的相对表达量均高于对照组。

图1 芡实提取物对克氏原螯虾肝胰腺组织中免疫相关基因转录水平的影响Fig.1 Effects of EF extracts on the expression of immune-related genes in hepatopancreas tissue of crayfish“*”代表与对照组相比有显著差异(P<0.05)

2.4 嗜水气单胞菌感染克氏原螯虾存活率的变化

对各组动物进行嗜水气单胞菌攻毒，72 h后对照组和0.5%、1%、2%芡实提取物组的存活率分别为25%、40%、25%、30%(图2)，各实验组之间的存活率没有显著差异。

图2 芡实提取物对克氏原螯虾嗜水气单胞菌攻毒后存活率的影响Fig.2 Effects of EF extracts on antioxidant capacity of crayfish

3 讨论

3.1 芡实提取物对克氏原螯虾生长和嗜水气单胞菌感染的影响

本研究发现，与对照组相比，饲料中添加一定量的芡实提取物对克氏原螯虾的生长无显著影响。Bilen等研究黄栌对虹鳟()的免疫刺激作用结果与本研究一致，结果显示黄栌对虹鳟生长速度和平均体重无显著影响。研究表明，多种中草药提取物通过抑制病原微生物感染，提高免疫酶活性和抗氧化水平，降低氧化应激，可间接提高饲料效率，提高水生动物生长性能。胡文攀等在淇河鲫()基础饲料中添加怀山药皮，发现其能提高淇河鲫的生长率和增重率，但效果不显著。这与本研究芡实提取物对克氏原螯虾无明显促进生长作用的结果相似。

药用植物除了可以提高机体的免疫功能外，另外一个重要作用就是它所含的活性成分对致病菌的杀灭作用。葛家琪的实验也已证明芡实提取物对包括嗜水气单胞菌在内的几种水产致病菌的抑菌效果。冯琪元等发现添加复方中草药可提高虹鳟感染鲁氏耶尔森菌()后的存活率。嗜水气单胞菌攻毒实验显示，添加芡实提取物饲料组对克氏原螯虾攻毒后的存活率与对照组没有显著影响。在本研究中，我们只选择了最短的有效时间来确定芡实提取物对克氏原螯虾生长和嗜水气单胞菌感染后的影响，而关于克氏原螯虾在不同时间点的变化仍需要进一步研究。

3.2 芡实提取物对克氏原螯虾抗氧化作用和免疫作用的影响

抗氧化酶是抵抗活性氧损伤的第一道防线，超氧化物歧化酶(SOD)活性可以清除过量的活性氧，保护机体免受活性氧的伤害。现有研究发现复方中草药可以通过增强尼罗罗非鱼()血清SOD活力，提高其非特异性免疫力。陈蓉等研究表明芡实的水提醇沉物和脂溶性物质都具有较好的清除自由基的作用。Wu等发现，芡实多糖具有增强总抗氧化能力(T-AOC)，提高超氧化物歧化酶(SOD)活性的作用，本研究结果也证明了这一点。大多数甲壳类动物缺乏真正的自适应免疫系统，主要依靠非特异性免疫，如细胞和体液免疫应答。本研究同时测定了两种氧化应激生物标志物SOD和CAT的活性，结果显示饲料中添加2%浓度的芡实提取物可提高克氏原螯虾血清中SOD的活性，表明芡实提取物可以增强机体抗氧化能力，减少抗氧化损伤。甲壳类动物的体液免疫主要依赖于酚氧化酶(PO)、AKP和ACP等酶类，AKP在鱼虾营养物质的吸收和利用中发挥着重要作用，有助于提高鱼虾的抗病能力；ACP是巨噬细胞中溶酶体的标记酶，与物质代谢密切相关，在免疫应答中发挥重要作用，可被外源性物质诱导。相关研究表明，应用免疫增强剂后，各种生物体内ACP、AKP的活性均有类似的提高。本实验结果表明，饲料中添加0.5%浓度的芡实提取物可以提高克氏原螯虾肝胰腺中ACP和血清中ACP、AKP的活性，而添加1%、2%浓度的芡实提取物则会降低血清中ACP的活性，说明适量浓度的芡实提取物可以促进机体的体液免疫，增强其非特异性免疫。

CypA是环孢素A(cyclosporine A，CSA)的主要胞内受体，是一种有效的免疫抑制药物，可以与过氧化物还原蛋白相互作用，激活过氧化物酶活性。在本研究中，添加2%的芡实提取物组的CypA mRNA表达水平显著升高。有研究表明，CypA在斑节对虾()、斑点叉尾鮰()等水生动物先天免疫系统中发挥着重要作用。GPx在吞噬和生理代谢过程中迅速产生的脂质和过氧化氢的解毒中起着至关重要的作用，同时伴随着谷胱甘肽的氧化，可以将有毒过氧化物还原为无毒的羟基化合物，从而保护细胞膜的结构和功能不受过氧化物的干扰和破坏；GPx在早期卵巢中特异性表达，可能在防止卵母细胞氧化损伤并因此在甲壳类动物繁殖中起关键作用。本研究结果表明，添加2%的芡实提取物组的mRNA表达水平显著升高。Astacidin是克氏原螯虾中的另一种抗菌肽(antimicrobial peptides，AMP)，它参与抗菌免疫反应。本研究发现添加芡实提取物组的mRNA表达水平均高于对照组，这与南美白对虾和印度明对虾()的研究结果一致。以上结果表明，饲料中添加适量浓度芡实提取物可以增强克氏原螯虾的抗氧化酶和免疫相关酶的活性，促进免疫相关基因的表达，从而提高其非特异性免疫力。