瞿瑜杉，吉宏武,2，宋文奎，彭 烁，詹苏泓，韦柳益，陈 铭，张 迪，刘书成,2

扁舵鲣抗氧化肽分离纯化及结构鉴定

瞿瑜杉1，吉宏武1,2，宋文奎1，彭 烁1，詹苏泓1，韦柳益1，陈 铭1，张 迪1，刘书成1,2

（1. 广东海洋大学食品科学学院 // 广东省水产品加工与安全重点实验室 // 广东省海洋生物制品工程实验室 // 广东省海洋食品工程技术研究中心 // 广东省高等学校水产品深加工重点实验室，广东 湛江 524088；2. 大连工业大学海产品深加工协同创新中心，辽宁 大连 116034）

【目的】从扁舵鲣（）的木瓜蛋白酶酶解产物中分离鉴定具有较高1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除率的抗氧化肽。【方法】用木瓜蛋白酶水解扁舵鲣，以DPPH自由基清除能力为检测指标，通过超滤、凝胶过滤层析和反向高效液相色谱分离抗氧化肽，再经过超高效液相/三重四级杆飞行时间质谱（UPLC / Xevo G2-XS QTOF）进行结构鉴定。【结果】从酶解产物中获得3种抗氧化肽，其氨基酸序列分别为-丙氨酸-1-甲基--组氨酸（241 u）、Gly-Ala-Gly-Gly-Pro（357 u）和Val-Glu（246 u）。【结论】扁舵鲣的木瓜蛋白酶酶解产物含有抗氧化活性的肽类，可为其抗氧化肽的开发提供理论依据。

扁舵鲣；抗氧化肽；分离纯化；结构鉴定

扁舵鲣（）广泛分布于太平洋、大西洋、印度洋地区。因其腥味重、口感差，普通肉一般加工成罐头，暗色肉直接丢弃或者加工成鱼粉，经济价值极低。但是，扁舵鲣肉富含蛋白质，氨基酸组成丰富[11]。研究表明，扁舵鲣蛋白酶解物富含抗氧化性氨基酸、芳香族氨基酸[12]，这些氨基酸在抗氧化方面中起着至关重要的作用[13]。同时，鲣鱼含有丰富的肌肽和鹅肌肽[14]，具有抗氧化[15]、降尿酸[16]等多种功效。因此，扁舵鲣蛋白可以作为抗氧化肽的新来源。目前还未见用扁舵鲣制备抗氧化肽报道。

蛋白质酶解产物复杂多样，包含游离氨基酸、不同分子质量的肽、未完全酶解的蛋白质等，这些均会影响多肽的抗氧化能力，因此需要采用多种分离手段得到活性更强的抗氧化肽。目前蛋白质水解物分离通常采用超滤和色谱分离相结合，将其高活性部分通过质谱鉴定出目标抗氧化肽序列。例如于辉等[17]将细点圆趾蟹（）含肉下脚料酶解物通过超滤、Sephadex G-15凝胶色谱、半制备RP-HPLC，分离得到2种抗氧化肽。Hye等[18]将日本叉牙鱼（）酶解产物通过超滤、制备型高效液相和反相高效液相色谱，分离纯化出1,1-二苯基-2-三硝基苯肼DPPH自由基清除活性大于66%的抗氧化肽Ala-Thr-Ser-His-His。O’Keeffe等[19]通过超滤和半制备反相高效液相色谱对乳清蛋白浓缩水解物进行连续分离，得到Val-Ala-Gly-Thr、Met-Ala-Ala和Met-Pro-Ile３种新型肽。

本研究通过木瓜蛋白酶水解扁舵鲣获得抗氧化肽，用超滤、体积排阻色谱和反相高效液相色谱进行连续分离和纯化抗氧化肽，最后通过超高效液相/三重四级杆飞行时间质谱（UPLC/Xevo G2-XS QTOF）鉴定抗氧化肽，为扁舵鲣多肽在功能食品上的应用提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

扁舵鲣（），购于中国广东兴亿海洋生物工程有限公司，全程冷链运输至实验室，-20 ℃保存至使用。木瓜蛋白酶（200 U/mg），购自广西南宁庞博生物科技有限公司；DPPH试剂盒，购自中国南京建成生物工程研究所；葡聚糖凝胶G-15，购自上海源叶生物；乙腈、甲醇、三氟乙酸（色谱级），均购自美国Sigma公司；反相C18色谱柱（COSMOSIL C18-MS-II），购自日本Nacalai Tesque公司。

1.2 扁舵鲣水解物的制备

在温度60 ℃，pH 6，添加木瓜蛋白酶600 μ/g，质量（mg）体积（mL）比1∶3，将扁舵鲣鱼肉流水解冻后匀浆、均质，酶解4 h。酶解后，在沸水浴中加热20 min，冷却至室温，4 ℃（8 000 r/min、20 min）离心，取上清液冷冻干燥，储存于-20 ℃待进一步分析。

1.3 DPPH自由基清除活性的测定

取400 μL的样品溶液与600 μL的10-4mol/L DPPH工作液混匀，在室温下避光孵育20 min，用分光光度计在517 nm下测光密度值。空白对照用等体积的蒸馏水替代样品，其他以相同方式进行[20]。DPPH自由基清除率（%）计算如下：

DPPH自由基清除率 = 1 -（1-2）/0,

其中，1是样品 + DPPH；2是样品+甲醇；0是甲醇+DPPH。

1.4 抗氧化肽纯化

1.4.1 超滤 将扁舵鲣酶解产物通过孔径200 nm的无机陶瓷膜分离，再将收集液依次通过10 ku、5 ku、1 000 u的超滤膜过滤，分别收集>10 ku、5 ～ 10 ku、1 000 u ～ 5 ku、<1 000 u四个组分并且浓缩、冷冻干燥得到干粉，保存于-20 ℃，测试每个组分的DPPH自由基清除能力，谷胱甘肽（GSH）用作阳性对照。

1.4.2 Sephadex G-15凝胶柱层析 取适量的Sephadex G-15凝胶干粉在热水中溶胀2 h，每0.5 h搅拌一次，去除水表面的漂浮物。然后将溶胀好的Sephadex G-15凝胶倒入柱中。用水作为流动相并以2.5 mL/min的流速压柱，直到得到稳定的凝胶柱（26 mm×60 cm）。7 mL样品溶液（30 mg/mL）通过凝胶柱纯化，用超纯水以2.5 mL/min洗脱。在220 nm处检测流出物光密度。使用自动收集器收集每个洗脱峰并浓缩、冷冻干燥得到干粉，保存于-20 ℃，然后测定其DPPH自由基清除能力。

(2)锚索、锚杆设计岩土工程参数参考值。根据《建筑边坡工程技术规范》(GB 50330—2002)推荐值并结合实际综合考虑，推荐砂浆与螺纹钢筋的粘结强度为2 000 kPa，砂浆与钢绞线的粘结强度为2 500 kPa，砂浆与片麻岩的粘结强度为1 000 kPa。

1.4.3 反相高效液相色谱分离 将通过Sephadex G-15凝胶获得最高DPPH清除活性的组分溶于超纯水中，使用COSMOSIL C18-MS-II色谱柱（内径4.6 mm，长250 mm）通过半制备高效液相色谱分离出抗氧化活性最高的组分。以乙腈和超纯水作为流动相，在质量浓度5 mg/mL，流动相为水和乙腈体积比 = 85%∶15%的混合液，流速0.8 mL/min，柱温25 ℃的条件下，将凝胶过滤得到的最高DPPH清除活性组分进行反向液相色谱分离。在220 nm条件下，按峰收集合并后浓缩、冷冻干燥，保存于-20 ℃，然后测定其DPPH自由基清除能力。

1.4.4 氨基酸序列分析 将2.4.3中纯化得到的扁舵鲣鱼蛋白肽溶于去离子水中，通过Xevo G2-XS QTOF（Waters，USA）分析具有最高抗氧化能力的肽的氨基酸序列。操作条件如下：进样量100 μL，流速0.2 mL/min。毛细管电压2.5 K，样品锥40，偏差控制180，正离子模式，喷雾温度400 ℃，MS/MS电压源25 kV。

1.5 统计分析

本实验采用JMP14.0软件进行显著性分析，采用Origin9.0软件绘图。采用检验分析组间差异，以< 0.05为差异有统计学意义。所有数据均用均数±标准差表示。

2 结果与讨论

2.1 超滤分离及各组分的抗氧化活性

将扁舵鲣酶解液连续通过10 ku、5 ku、1 ku的膜分离，得到4组不同分子质量的组分：ATH-I（>10 ku）、ATH-II（5 ～ 10 ku）、ATH-III（1 ～ 5 ku）、ATH-IV（<1 ku），其DPPH自由基清除活性如图1所示。ATH-IV表现出最高的自由基清除活性（半抑制浓度（IC50）= 3.61 mg/mL），而ATH-I对DPPH自由基清除能力最弱（IC50= 6.79 mg/mL）。结果表明，多肽的分子质量与其抗氧化性密切相关，即低分子质量的组分可能含有更有效的抗氧化肽。类似的，Ahn等[21]从鲑（）水解物中分离出的低分子质量肽具有更高的抗氧化活性；Wang等[22]发现，蓝贻贝（）水解产物<1 ku组分具有更高的DPPH自由基清除力。分子质量较低的肽能更有效的与氧化过程的自由基相互作用[23]。因此，选择组分ATH-IV进行下一步的分离。

凡含一个相同字母表示差异不具统计学意义（P > 0.05）

2.2 凝胶过滤色谱分离及各组分抗氧化活性

图2(A)所示，ATH-IV组分经过Sephadex G-15凝胶柱分离出4个不同的级分，分别记为F1、F2、F3、F4。如图2(B)所示，F1对DPPH自由基的清除活性最高，其IC50值为3.43 mg/mL。因此，选择F1进行进一步分离纯化。

凡含一个相同字母表示差异不具统计学意义（P > 0.05）

2.3 反相高效液相色谱进一步分离及各组分的抗氧化活性

在检测波长220 nm下进行多次反复验证，得到分离色谱图（图3）。结果显示，F1-1的活性（IC50= 1.53 mg/mL）远高于F1-2（IC50= 54.19 mg/mL）。经鉴定F1-3为氨基酸，而单个氨基酸的抗氧化活性远远低于肽[24]，因此选择F1-1进行下一步结构特征鉴定。

2.4 UPLC－MS／MS鉴定抗氧化肽氨基酸序列

肽的抗氧化活性与分子质量、氨基酸组成与排列有关[25]。通过超高效液相色谱中观察到3个主要峰（如图4(A)）。通过QTOF-MS分析肽的分子质量，再通过QTOF-MS-MS分析肽的表征。图4(B-D)为峰1、2、3的MS图，其中质荷比m/z依次为241.1、357.3、246.2离子峰最高。因此选择m/z = 241.1、357.3和246.2为母离子进行MS/MS分析。

图3 F1液相分离色谱

图5(A)为来自母离子（m/z = 241.1）的MS/MS图。结合分子质量以及在MS/MS图中的碎片峰，发现其与wang等[26]报道的鹅肌肽MS/MS图一致，因此断定峰1为鹅肌肽。

图5(B)为母离子（m/z = 357.3）二级质谱图。结果显示，该系列的m/z值分别为5= 357.3，4= 301.1，3= 230.2，2= 173.1，1= 116.1。母离子m/z为357.3，通过五个系列离子相减，依此为5-4= 56.2、4-3= 70.9、3-2= 57.1、2-1= 57.0、1= 116.1。除1其余加上18（H2O），显示相应的氨基酸残基分别为Gly、Ala、Gly、Gly。y1缺失一个H+正好对应氨基酸残基为Pro。因此推测前体离子氨基酸序列为Gly-Ala-Gly-Gly-Pro。通过计算GAGGP相对分子质量发现与质谱中的一致。

图5(C)为母离子（m/z = 246.2）的二级质谱图。根据结果所示，该系列的m/z值分别为3= 246.2，2= 229.2，1= 130.1。母离子的m/z为246.2，通过3个系列离子相减，依此为3-2= 17、2-1= 99.1、1= 130.1，由此可推断为二肽。对应y2端氨基酸残基为Val，缬氨酸脱去一个H2O，m/z = 99。1- 1= 129，谷氨酸得到一个H2O，m/z=147，因此1端对应的氨基酸残基为Glu。计算相对分子质量VE，结果为117 + 147 - 18=246，与质谱给出的值一致，故母离子（m/z = 246.2）的氨基酸序列为Val-Glu。

含有2 ～ 10个氨基酸的寡肽比其他大多数多肽或者蛋白质具有更高抗氧化潜力[27]。多肽活性不仅取决于分子质量，还与氨基酸组成和结构中序列有关[28]。研究报道表明，Tyr、Pro、Val等疏水性氨基酸在清除食品自由基方面发挥了显著作用[29-30]。Ranathunga等[31]发现，星康吉鳗（）蛋白水解物中纯化的抗氧化肽由55%的疏水残基组成肽中的疏水性氨基酸对其抗氧化作用有很大贡献。Mendis等[32]从柔鱼（）皮明胶中纯化抗氧化肽，发现肽序列含有的Pro、Gly、Ala、Val、Leu等氨基酸具有强抗氧化活性。通过扁舵鲣蛋白水解液纯化出的３种抗氧化肽分别为鹅肌肽、五肽（由甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸组成）以及二肽（由缬氨酸和谷氨酸组成）。鹅肌肽是一种主要分布在动物体内的组氨酸二肽，已被证明其具有多种功能，如抗氧化[33]、抗糖化[34]以及改善运动能力[35]的作用。GAGGP中甘氨酸、脯氨酸为疏水性氨基酸，占总肽的80%，这能增强肽的抗氧化活性，使多肽与脂质双层膜相互作用，抑制脂肪过氧化[36]，脯氨酸的吡咯环可以增加肽的柔韧性，并且由于其具有较低的电离势，可以猝灭单线态氧[37]。VE中也含有疏水性氨基酸，并且其位于N端被认为通过增加水-脂质界面处的密度而有助于抗氧化活性[38]，谷氨酸在去除过氧化氢过程中通过产生氧化型谷胱甘肽来提供抗氧化活性[39]。

（A）F1-1的UPLC色谱图；（B-D）峰1、2、3 MS图

图5 F1-1各肽段的二级质谱

3 结论

采用木瓜蛋白酶对扁舵鲣进行酶解，酶解产物通过膜分离和色谱分离相结合的方法分离得到3个抗氧化肽，经过质谱鉴定发现，３个抗氧化肽的氨基酸序列分别为β-丙氨酸-1-甲基-L-组氨酸（241 u）、Gly-Ala-Gly-Gly-Pro（357 u）和Val-Glu（246 u）。

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（责任编辑：刘朏）

Isolation, Purification and Structural Identification of Antioxidant Peptides from

QU Yu-shan1, JI Hong-wu1,2, SONG Wen-kui1, PENG Shuo1, ZHAN Su-hong1, WEI Liu-yi1, CHEN Ming1, ZHANG Di1, LIU Shu-cheng1,2

（1.,////////,524088,; 2.,,116034,）

【Objective】To isolate and identify antioxidant peptides with high DPPH free radical scavenging ability from papain hydrolysate of.【Method】Antioxidant peptides in the hydrolysates were initially purified using ultrafiltration, gel filtration chromatography and reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC). Then, the antioxidant activities of each component were determined by DPPH free radical scavenging ability. Their peptide sequences were identified by ultra-performance liquid chromatography / triple quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC / Xevo G2-XS QTOF). 【Results】Three antioxidant peptides were purified from the hydrolysates, and their peptide sequence were-alanine-1-methyl-L-histidine (241 u), Gly-Ala- Gly-Gly-Pro (357 u) and Val-Glu (246 u), respectively. 【Conclusion】Antioxidant peptides existed in papin hydrolysate of, which provides a theoretical basis for the development of its antioxidant peptides.

; antioxidant peptide; isolation and purification; structure identification

S931.4

A

1673-9159（2022）01-0113-07

10.3969/j.issn.1673-9159.2022.01.015

瞿瑜杉，吉宏武，宋文奎，等. 扁舵鲣抗氧化肽分离纯化及结构鉴定[J]. 广东海洋大学学报，2022，42（1）：113-119.

2021-11-20

国家重点研发计划（2019YFD0902004）

瞿瑜杉（1995―），女，硕士研究生，研究方向为水产品加工及贮藏工程。E-mail：quys@foxmail.com

吉宏武（1962―），男，博士，教授，研究方向为水产品加工及贮藏工程。E-mail：jihw62318@163.com