蓝蔚青，张炳杰，张 溪，谢 晶

微酸性电解水结合复合保鲜剂对凡纳滨对虾冷藏期间蛋白特性影响

蓝蔚青1,2,3，张炳杰1，张 溪1，谢 晶1,2,3

（1. 上海海洋大学食品学院 // 2. 上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心 // 3. 上海海洋大学食品科学与工程国家级实验教学示范中心，上海 2013061）

【目的】研究微酸性电解水（SAEW）结合迷迭香提取物（RE）-柠檬酸（CA）复合保鲜剂处理对凡纳滨对虾（）冷藏期间蛋白特性变化影响，探讨此法用于虾类贮藏保鲜的效果。【方法】将样品分别经SAEW、质量分数4% RE＋质量分数1% CA（RC）、SAEW结合RC（SAEW+RC）和无菌水（CK）处理10 min后，自然沥干15 min，装入PE保鲜袋于（4±1）℃冰箱中保藏，每2 d测定样品的pH值、总挥发性盐基氮（TVB-N）、总巯基含量、Ca2+-ATPase活性、化学键、肌原纤维小片化指数（MFI）与内源荧光强度（IFI）等指标，并结合聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行综合分析。【结果】复合处理能延缓凡纳滨对虾贮藏期间pH与TVB-N值的升高，抑制总巯基含量下降，CK、RC、SAEW与SAEW+RC组样品的Ca2＋-ATPase活力分别由初始0.16、0.17、0.17与0.17 μmol/(mg·min) 降至0.12、0.13、0.12与0.14 μmol/(mg·min)，MFI值较初始值上升1.88、1.73、1.76和1.54倍，可见SAEW+RC对延缓Ca2+-ATPase活性下降与MFI值的上升有较好作用。同时，SAEW+RC处理还能减缓蛋白质分解、氧化和变性，保持蛋白质化学键与IFI值的相对稳定。【结论】微酸性电解水结合复合保鲜剂处理能较好抑制凡纳滨对虾冷藏期间的蛋白质氧化分解，延缓其品质劣变。

微酸性电解水；迷迭香提取物；柠檬酸；凡纳滨对虾；蛋白特性

近年来，国内外研究学者已通过多种方式来保持虾类新鲜度，抑制其微生物和酶活性。微酸性电解水（slightly acidic electrolyzed water，SAEW）又名微酸性氧化电位水、微酸性次氯酸水，其方便制取，广谱杀菌，且无残留，因此通常作为杀菌剂广泛应用于鲜切果蔬、肉制品等食材的杀菌处理等食品工业中。Tantratian等[3]利用60 mg/L的微酸性电解水在4 ℃下浸泡牡蛎（）肉30 min，结果得出其有效降低牡蛎肉中的细菌总数；Xuan等[4]研究发现，用微酸性电解水冰贮藏柔鱼（）能显著的降低其细菌总数，抑制微生物生长。近年来，生物保鲜剂因其来源广泛、绿色安全等特点受到研究人员重视，并逐渐用于水产品保鲜[5]。迷迭香叶通过有机萃取得到酚酸类、萜类和黄酮等抗氧化和抗菌化合物，其可通过螯合金属离子来终止自由基反应，切断水产品中自由基的链式反应，减缓其蛋白质氧化[6]。其中，蓝蔚青等[7]利用1.0 g/L迷迭香提取物镀冰衣于-20 ℃冻藏条件下保存卵形鲳鲹（），结果得出其TVB-N与TBA值的上升速度明显减缓，表明迷迭香提取物延缓了卵形鲳鲹的蛋白质氧化变性和脂质氧化；Choulitoudi等[8]研究发现，迷迭香提取物涂层能延缓烟熏鳗（）片的氧化，改善其品质。柠檬酸为天然有机酸，也在食品加工中得到较好应用。其中，Mahmoud等[9]用5.0 mg/mL柠檬酸溶液浸泡牡蛎10 min，发现其能减少牡蛎中副溶血弧菌数，且抑菌率与处理液浓度呈正相关关系。

目前，微酸性电解水与保鲜剂相结合用于水果[10-11]、肉类[12-13]杀菌保鲜已有部分报道，但将微酸性电解水-复合保鲜剂复合开展虾类贮藏期间蛋白特性变化的研究报道鲜见。因此，本实验拟通过微酸性电解水结合复合保鲜剂处理凡纳滨对虾，通过测定其冷藏期间的pH、总挥发性盐基氮（TVB-N）、总巯基含量、Ca2+-ATPase活性、化学键、肌原纤维小片化指数（MFI）与内源荧光强度（IFI）等指标，并结合聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE分析，综合评价微酸性电解水结合复合保鲜剂对冷藏凡纳滨对虾蛋白特性变化影响，以期为虾类等水产品的保鲜加工提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验原料

凡纳滨对虾（）购自上海浦东新区农工商超市，虾龄60 d。选取体长（13±1）cm、体质量（15±1）g，外观完整且大小均一的鲜活样品。将鲜活样品置于充氧气泡沫箱中保活，30 min内运至实验室，加冰猝死。

1.2 主要药品试剂

迷迭香提取物（鼠尾草酸≥60%，食品级），购于上海畅硕生物科技有限公司；柠檬酸（纯度＞99%），购于河南省宏益生物科技有限公司；蛋白浓度测定试剂盒，购于生工生物工程（上海）股份有限公司；总巯基测试盒、Ca2+-ATPase测试盒，购于南京建成生物科技有限公司；氯化钾、轻质氧化镁、硼酸、盐酸、考马斯亮蓝G-250、冰醋酸、甲醇等，购于国药集团化学试剂有限公司，均为国产分析纯。

1.3 主要仪器设备

FX-SWS100型微酸性电解水生成机，烟台方心水处理设备有限公司；F-7100型荧光分光光度计，上海斯迈欧分析仪器有限公司；722型可见分光光度计，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；Synergy2自动酶标仪，美国BioTek公司；1658001型小型垂直电泳槽，美国biorad公司等。

1.4 实验方法

1.4.1 微酸性电解水制备 由微酸性电解水生成机电解体积分数9.0%HCl溶液制备。制备后微酸性电解水的pH值为（6.35±0.04），氧化还原电位（Oxidation-Reduction Potential，ORP）值为（861.6±12.35）mV，有效氯质量浓度（Available Chlorine Concentration，ACC）值为（30±1.54）mg/L。

1.4.2 原料处理 将样品洗净后随机分成4组，分别处理如下：1）样品在无菌水浸渍处理10 min（CK）；2）样品在质量分数1%柠檬酸与质量分数4%迷迭香提取物复配液浸渍处理10 min（RC）；3）样品在微酸性电解水浸渍处理10 min（SAEW）；4）样品在微酸性电解水后浸渍5 min后，在质量分数1%柠檬酸与质量分数4%迷迭香提取物复配液中浸渍处理5 min（SAEW+RC）。处理期间的虾水质量比为1∶2，将样品分别处理后，自然沥干后装入PE保鲜袋中，在（4±1）℃冰箱中贮藏。期间，每2 d进行各项指标测定。

1.4.3 pH值与TVB-N值 参考《食品安全国家标准食品pH值的测定》（GB5009.237-2016）[14]。称取5 g虾肉，加入45 mL蒸馏水，静置30 min后过滤，用pH计测滤液的pH值。参考《食品安全国家标准食品中挥发性盐基氮的测定》（GB 5009.228-2016）[15]，利用凯氏定氮仪测定其TVB-N值，结果以mg / 100g表示。

值为0 的区域属于非阴影栅格，值为1的区域说明仅在某一个时刻存在阴影；值为2的区域说明某两个时刻存在阴影；值为3 的区域表明该区域在3个时刻都为阴影区域；凡是值大于0 的地方，都是在 12∶00～14∶00 时间内有建筑遮挡的地方。

1.4.4 总巯基含量与Ca2+-ATPase活性 按总巯基含量试剂盒说明书，使用酶标法测定各组处理样液在412 nm处的光密度值，其中分子消光系数为13 600 L/(mol•cm)。同时，按超微量Ca2+-ATPase测试盒操作说明进行Ca2+-ATPase活性测定。

1.4.5 化学键 参照Wang等[16]法测定化学键。蛋白质含量据改良型Brodford法蛋白浓度测定试剂盒说明书测定其二硫键、离子键、氢键与疏水相互作用，结果以蛋白溶解质量浓度（g/L）表示。

1.4.6 肌原纤维小片化指数（myofibril fragmentation index，MFI） 参考Li等[17]提取肌原纤维蛋白（Myofibrillar Protein，MFP）。取2 g虾肉与20 mL缓冲液（20 mmol/L Tris-maleate，pH=7.0，0.05 mol/L KCl溶液）冰浴下匀浆，在4 ℃条件下，10 000 r/min离心15 min，将沉淀物与20 mL缓冲液均质，置于4 ℃条件提取1 h。随后，在4 ℃条件下10 000 r/min匀浆15 min。得到的上清液即为肌原纤维蛋白，将其冷藏存放，并在1 h内使用。参考Wang等[18]采用双缩脲法将MFP上清液调节质量浓度至0.5 mg/mL，酶标法测定波长540 nm处光密度值，按下列公式计算MFI值。

MFI =（540 nm）×150。

1.4.7 内源荧光强度 提取MFP溶液进行内源荧光1 200 nm/min扫描检测。采集参数：激发波长为295 nm，发射波长为300 ～ 400 nm，狭缝宽度为5 nm。

1.4.8 聚丙烯酰胺凝胶SDS-PAGE电泳 参考胡潇予等[19]提取虾样MFP上清液，并进行SDS-PAGE分析。采用考马斯亮蓝G-250染色1 h，用体积分数7.5%冰醋酸和体积分数5%甲醇脱色至条带清晰并进行成像分析。

1.5 数据处理

实验重复3次，数据统计分析采用SPSS 17.0软件，作图采用Origin 85软件，差异性显著分析采用单因素法，< 0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同处理方式对虾肉pH值与TVB-N值的影响

通常情况下，样品pH值随着贮藏时间的延长而相应升高，其与样品的可接受性密切相关。由图1(A)可知，在整个贮藏期间，尽管各组pH值差异性不大，但微酸性电解水与复合保鲜剂单一处理组、复合组样品的pH值均低于对照组，这与Shiekh等[20]研究结果一致。在贮藏10 d时，SAEW+RC组样品的pH值为8.02±0.04，RC组和SAEW组样品的pH值分别为8.21±0.06和8.30±0.05，而CK组样品的pH值为8.50±0.03。结果表明，SAEW+RC处理能保持虾样品质，降低其蛋白质分解速率。

样品在贮藏期间，细菌与蛋白酶的作用会使含氮化合物分解，导致虾肉中产生不可接受的气味。由图1(B)可见，贮藏期间，对照组样品的TVB-N值高于处理组。在6 d，对照组样品的TVB-N值为（31.34±0.84）mg/100g，已超过可接受限值（30 mg/100g）。RC、SAEW与SAEW+RC组样品在第8 d时的TVB-N值分别为（31.29±0.67）、（34.52±0.70）、（22.57±0.82）mg/100g。此时，RC与SAEW单一处理组样品已超过限值。而复合组样品直到10 d才达到腐败阶段，表明其对TVB-N的生成抑制效果显著，可能是因为微酸性电解水与柠檬酸对微生物产生失活效应，抑制了样品贮藏期间含氮类化合物的生成。

同一大写字母表示组内无显著差异（P > 0.05）；同一小写字母表示组间无显著差异（P > 0.05）

2.2 不同处理方式对虾肉总巯基含量与Ca2+-ATP酶活性的影响

由图2(A)可知，SAEW组、RC组和SAEW+RC组在贮藏期间的总巯基含量均高于CK组样品。样品在贮藏过程中，蛋白质发生氧化，导致分子结构的展开和构象变化。在贮藏过程中，蛋白质的总巯基（尤其是活性巯基）易形成二硫键，巯基暴露被氧化成磺酸或二硫键，使总巯基含量相应减少[21]。可能是因为微酸性电解水的广谱抑菌性和迷迭香提取物的抗氧化性双重作用，延缓了蛋白质结构展开，减少了总巯基暴露。

肌球蛋白特性的稳定与Ca2＋-ATP酶活性相关，其活性降低，反映蛋白质氧化与变性程度。如图2(B)所示，样品Ca2＋-ATP酶活性在冷藏期明显下降，且各组间Ca2＋-ATP酶活性差异显著（＜0.05）。CK、RC、SAEW与SAEW+RC组样品的Ca2＋-ATP酶活力由初始0.16、0.17、0.17和0.17 μmol/(mg·min)分别降至0.12、0.13、0.12和0.14 μmol/(mg·min)。虾类MFP的肌球蛋白分子包含的巯基变化影响Ca2＋-ATP酶活性，肌球蛋白头部因巯基氧化使其构象发生改变，Ca2＋-ATP酶活性相应降低[22]。

2.3 不同处理方式对虾肉肌原纤维小片化指数MFI值的影响

肌原碎片化指数表示肌原纤维损伤程度，反映其结构和结构蛋白完整性。MFI值越大，表示内部损坏越严重。由图3可知，各组样品MFI值在冷藏期间呈递增态势，其中CK组样品的MFI值与处理组差异显著（< 0.05）。肌原纤维受损与钙蛋白酶被激活导致Z盘相关的MFP降解相关。CK组、RC组、SAEW组和SAEW+RC组样品在冷藏期间分别较初始值上升了1.88、1.73、1.76和1.54倍。肌肉的MFI值和pH值变化呈负相关关系，两者变化趋势一致；此外，由于肌原纤维中的结构蛋白与细胞外基质蛋白水解，使肌原纤维的完整性受到破坏，因此更易发生机械断裂[23]。该结果与周大鹏等[24]研究结论一致。

同一大写字母表示组内无显著差异（P > 0.05）；同一小写字母表示组间无显著差异（P > 0.05）

同一大写字母表示组内无显著差异（P > 0.05）；同一小写字母表示组间无显著差异（P > 0.05）

2.4 不同处理方式对虾肉蛋白质化学键的影响

图4可知，凡纳滨对虾冷藏期间二硫键的蛋白溶解含量随着贮藏时间的延长而不断增加，其中处理组样品的含量显著低于对照组（＜0.05），且SAEW+RC组样品的含量最低。离子键和氢键的蛋白溶解含量随着贮藏时间的延长相应减少，而处理组样品的含量相对较高，显著高于CK组（＜0.05）；样品疏水相互作用的蛋白溶解含量呈上升趋势，其中对照组含量最高。可能是因为蛋白质氧化，促进离子键断裂，使疏水基团大量暴露并聚集[25]。复合保鲜剂含有的多酚类物质能以氢键和疏水方式与蛋白相互作用，使蛋白氧化减缓，减少疏水基团的暴露与离子键的断裂[26-27]。因此，微酸性电解水与复合保鲜剂处理能改善凡纳滨对虾贮藏期间的肌原纤维蛋白化学作用力，保持蛋白结构稳定。

2.5 不同处理方式对蛋白质内源荧光强度IFI值的影响

由图5可知，新鲜样品在336 nm处显示最高的荧光强度，表明此时其蛋白质结构完整。随着贮、藏时间的延长，各组样品的内源荧光强度值相应下降。其中，处理组样品的最高荧光强度始终显著高于对照组，且以复合处理组作用更明显。

同一大写字母表示组内无显著差异（P > 0.05）；同一小写字母表示组间无显著差异（P > 0.05）

内源荧光光谱是检测蛋白质三级结构的重要指标。芳香族残基由于其内源荧光特性在特定波长具有最大值。最大荧光发射波长（max）的相对位置表示暴露在蛋白质内部的芳香族残基。虾样肌原纤维蛋白的IFI值在冷藏期间下降与色氨酸残基位置从疏水环境暴露密切相关[28]。内源荧光强度值的下降可能是因为凡纳滨对虾在贮藏期间，其肌原纤维蛋白结构逐渐展开，色氨酸残基等荧光物质暴露在极性环境中，蛋白质三级结构发生变化，使内源荧光强度降低。而微酸性电解水与复合保鲜剂处理破坏了蛋白质的疏水区域，使芳香基团暴露，荧光强度相应增大[29]。各组样品随着贮藏时间的延长，蛋白质进一步伸展，色氨酸暴露于溶剂中，产生猝灭作用，荧光强度随之降低[30]。由此表明，微酸性电解水与复合保鲜剂结合处理，改变了凡纳滨对虾肌原纤维蛋白的结构完整性。该结果与总疏基含量变化趋势一致。

2.6 不同处理方式下虾肉肌原纤维的聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE变化

由图6可知，各组样品在冷藏期间条带颜色逐渐变淡。其中，对照组样品在高分子质量区的条带逐渐变浅，而在50 ku左右的条带颜色加深，表明此时样品中的肌原纤维蛋白已发生明显降解。在贮藏10 d时，RC组样品的条带呈现分子质量较大的蛋白质聚合体，说明蛋白间发生聚集交联[31]。CK组中肌球蛋白重链的条带密度在10 d最弱，而其他处理组仅略有降低。

肌球蛋白重链（220 ku）、肌动蛋白（43 ku）和肌球蛋白（38 ku）与蛋白质氧化密切相关。一般来说，高分子链出现是由于蛋白质交联和积累，而小分子链出现可能由于高分子链降解[32]。因此，SDS-PAGE能显示样品中肌原纤维蛋白的降解情况。样品在冷藏期间内源性酶的催化下，肌原纤维蛋白发生相应降解，条带颜色逐渐变淡。而由于肌球蛋白重链易受氧化降解，贮藏10 d时CK组中肌球蛋白重链被分解成相对较小分子量的蛋白质，导致CK组在条带密度较其他组弱。而肌动蛋白和肌球蛋白在不同样品的所有条带中无明显变化，可见微酸性电解水-复合保鲜剂结合具有良好的抗氧化活性，延缓了凡纳滨对虾贮藏期间巯基和蛋白质氧化，防止其降解。

图5 不同处理方式对凡纳滨对虾冷藏期间内源荧光强度变化影响

图6 不同处理方式下凡纳滨对虾肌原纤维蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳

3 结论

凡纳滨对虾在冷藏期间经微酸性电解水结合复合保鲜剂处理后，能减缓其pH、TVB-N与MFI值的上升速率，通过抑制其总巯基含量与Ca2＋-ATPase活性的下降，保持蛋白质化学键与IFI值的相对稳定，减缓蛋白质氧化分解，保持其良好的蛋白特性，延缓其品质劣变。该研究结果将对后期凡纳滨对虾的保鲜加工提供理论参考。

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Effects of Slightly Acidic Electrolyzed Water Combined with Compound Preservative on the Protein Characteristics of Pacific white shrimp () During Refrigerated storage

LAN Wei-qing1,2,3, ZHANG Bing-jie1, ZHANG Xi1, XIE Jing1,2,3

（1.// 2.// 3.,201306,）

【Objective】The effects of slightly acidic electrolyzed water combined with compound preservative on the protein characteristics of Pacific white shrimp () during refrigerated storage were measured. 【Methods】Samples were impregnated with slightly acidic electrolyzed water (SAEW), compound preservatives (rosemary extract+citric acid, RC), slightly acidic electrolyzed water and a compound preservative (SAEW+RC) and sterile water (CK) treatment for 10 min. The samples were drained for 15 min, and put in PE bags and stored in a refrigerator at (4±1) ℃. Different indexes, such as pH, TVB-N, total sulfhydryl content, Ca2+-ATPase activity, chemical bond, MFI and IFI, and also in combination with SDS-PAGE, were analyzed respectively. 【Results】SAEW+RC treatment could delay the increase of pH and TVB-N value, inhibit the decrease of total sulfhydryl content. The Ca2+-ATPase activity of CK, RC, SAEW and SAEW+RC samples were decreased from 0.16, 0.17, 0.17 and 0.17 μmol/(mg·min) to 0.12, 0.13, 0.12 and 0.14 μmol/(mg·min) respectively. The MFI value had increased by 1.88, 1.73, 1.76 and 1.54 times respectively compared with the initial value. It can be seen that SAEW+RC has a beneficial effect on delaying the decline of Ca2+-ATPase activity and the raise the MFI value. At the same time, it can also slow down protein decomposition, oxidation and denaturation, and maintain the relative stability of protein chemical bond and IFI value.【Conclusion】slightly acidic electrolyzed water combined with compound preservative treatment could inhibit the oxidation and decomposition of protein, delay the quality lost of pacific white shrimp during refrigerated storage.

slightly acidic electrolyzed water; rosemary extract; citric acid;; protein characteristic

Q939.11

A

1673-9159（2022）01-0098-08

10.3969/j.issn.1673-9159.2022.01.013

蓝蔚青，张炳杰，张溪，等. 微酸性电解水结合复合保鲜剂对凡纳滨对虾冷藏期间蛋白特性影响[J]. 广东海洋大学学报，2022，42（1）：98-105.

2021-08-18

“十三五”国家重点研发计划重点专项 (2019YFD0901602)；现代农业产业技术体系建设专项（CARS-47-G26）；上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心能力提升项目（19DZ2284000）

蓝蔚青（1977―），男，博士，高级工程师，研究方向为水产品加工及贮藏工程。E-mail: wqlan@shou.edu.cn

谢晶（1968―），女，教授，博士，研究方向为食品保鲜技术。E-mail: jxie@shou.edu.cn

（责任编辑：刘朏）