刘 怡，陈敏琪，张 翼,3，千忠吉,3

海洋土曲霉C23-3代谢产物epi-aszonalenin A对内皮细胞的活性机制

刘 怡1，陈敏琪2，张 翼2,3，千忠吉1,3

（广东海洋大学1.化学与环境学院 / 2.食品科技学院，广东 湛江 524088；3. 广东海洋大学深圳研究院，广东 深圳 518120）

【目的】探究海洋土霉菌代谢产物epi-aszonalenin A（EAA）对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导HUVEC人脐静脉内皮细胞的动脉粥样硬化斑块内血管新生的作用。【方法】用CCK法检测细胞活力，DCFH-DA法测定活性氧（ROS）的含量，划痕实验检测细胞迁移能力，血管生成实验检测细胞成管能力，酶联免疫吸附法ELISA试剂盒检测LOX-1和VEGF蛋白表达情况，蛋白免疫印迹法检测MAPK通路、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）的蛋白的表达情况，分子对接模拟EAA与LOX-1蛋白的相互作用。【结果】CCK法证明EAA对HUVEC细胞无明显毒性作用（> 0.05）；与空白组相比，EAA对HUVEC细胞的迁移和血管生成起到显著抑制作用（< 0.001）；与对照组相比，随着实验组EAA浓度增加，细胞内ROS含量显著减少（< 0.001），LOX-1、VEGF、MAPK通路蛋白p38、JNK、ERK的磷酸化和ICAM-1、VCAM-1的表达也显著降低（< 0.001）；此外EAA能与LOX-1形成稳定的相互作用。【结论】EAA能清除ROS，抑制HUVEC细胞炎性因子的表达和血管生成。

土曲霉；代谢产物；人脐静脉内皮细胞；血管生成；抗炎；氧化型低密度脂蛋白

动脉粥样硬化（Atherosc1erosis，As）是一种炎症性心血管疾病，是引起冠心病、脑梗死、血栓塞性疾病等多种疾病主要原因[1]。其典型特征之一是斑块内氧化修饰的低密度脂蛋白（ox-LDL）的积累，这些脂蛋白可通过特定受体，即凝集素型氧化LDL受体(LOX-1)[2]，导致氧化应激，细胞内ROS过量积累，从而诱导内皮细胞的功能障碍和凋亡。由ox-LDL引起的AS主要由内皮受体LOX-1介导，而LOX-1过度表达可导致内皮激活和损伤[3]，同时会诱导AS疾病中的斑块形成[4]。研究表明[5]，低氧环境对AS疾病发展有促进作用，使低氧诱导因子-1α（HIF-1α）的蛋白表达增加，而后能对VEGF的蛋白分泌激活诱导，从而刺激其生长最终导致血管新生[6]。VEGF作为主要的一种人体内血管生成的关键调控因子，是促进血管新生被研究最多的关键蛋白[7]。血管生成在AS疾病进展中有重大意义，缺氧和炎症状态会使血管生成和炎症因子过度表达，促进AS病变区域的斑块发展，稳定性降低，从而引起斑块出血、破裂或其他病变衍生[8]。AS同时会引起VEGF下游通路MAPKs的过表达[9]，也会引起内皮细胞血管新生因子和包括黏附分子（ICAM-1、VCAM-1）的过度表达[10]，又会引起进一步刺激血管新生因子和炎症因子，激发正反馈机制，动脉粥样硬化中形成不稳定斑块，出血或破裂后造成急性冠状动脉综合征[11-12]。但目前已有抗血管生成药物在临床应用中副作用极大[13-14]。因此，需要找到更好应用于抗动脉粥样硬化斑块血管生成特效药物。

近年来对内生真菌和海洋真菌的研究越来越多，这些真菌为筛选新的高活性低毒性天然产物提供了一线希望[15]。epi-aszonalenin A（EAA）是一种从广东徐闻的牡丹珊瑚()内分离的土曲霉C23-3代谢产物。海洋真菌土曲霉C23-3(GDMCC No.60316)采自徐闻珊瑚自然保护区，现保存于广东省微生物菌种保藏中心。土曲霉()属于子囊菌门内，是广泛存在于海洋和陆地的一种真菌[16]。

有许多研究发现并证明土曲霉衍生化合物具有抗炎、抗氧化活性[17-18]，但是未见关于抗动脉粥样硬化的活性成果报道。生物碱EAA目前为止也未见研究报道，是一种未被开发活性的潜在可利用生物碱。因此，本研究以抗动脉粥样硬化疾病中斑块病变的方向来研究EAA的抗炎、抗血管生成作用机制，从而为海洋土曲霉代谢产物在海洋药物研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

人脐静脉内皮细胞HUVEC（苏州北纳创联生物技术有限公司）；低密度脂蛋白ox-LDL（上海源叶生物科技有限公司）；LOX-1 ELISA试剂盒、VEGF ELISA试剂盒（武汉酶免生物科技有限公司）；小鼠多克隆抗体p38(sc-535)、p-p38(sc-166182)、JNK(sc-7345)、p-JNK(sc-6254)、ERK(sc-94)、p-ERK(sc-81492)、ICAM-1(sc-107)、VCAM-1(sc-13106)、羊抗鼠IgG-HRP(sc-2005)（美国Santa Cruz Biotechnology）。

酶标仪（Bioteck仪器公司）；显微镜（广州吉迪有限公司）；细胞计数仪（Bioteck仪器公司）；小型垂直电泳槽和电转槽（Bio-Rad公司）；全自动化学发光成像分析系统（上海天能科技有限公司）；凝胶成像系统（Bio-Rad公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 土曲霉代谢物提取与分离 土曲霉C23-3菌株在马铃薯葡萄糖培养液(PDB)中在1 L烧瓶中在28℃、150 r/min的摇床上发酵7 d。完成后，将培养物过滤，分离出上清液和菌丝体，分别用乙酸乙酯和乙酸乙酯加氯仿-甲醇（体积分数1∶1），混合液提取。合并两种提取物并真空浓缩成粗提取物。该提取物在Sephadex LH-20柱上分离，用氯仿-甲醇（体积分数1∶1）洗脱，得到不同馏分。Fr6通过Sephadex LH-20柱进一步纯化，由甲醇洗脱，然后通过制备型RP-18 HPLC以体积分数70∶30甲醇-水洗脱，得到纯化合物epi-aszonalenin A[19]。

Epi-aszonalenin A, 白色无定型粉末，1H结果(CDCl3):H6.04 (1H, s, H-2)，7.32 (1H, dd,= 7.4, 1.8 Hz, H-5)，7.10 (1H, m, H-6), 7.20 (1H, m, H-7)，7.84 (1H, m, H-8)，3.05 (1H, d,=13.1 Hz, H-10a)，2.49 (1H, dd,= 13.1, 9.7 Hz, H-10b)，4.02 (1H, d,= 9.7 Hz, H-11)，6.75 (1H, d,= 8.0Hz, H-15)，7.39 (1H, td,= 7.2, 1.4 Hz, H-16)，7.20 (1H, m, H-17)，7.98 (1H, d,= 7.0Hz, H-18)，5.81 (1H, dd,= 17.4, 10.9Hz, H-23)，5.10 (1H, d,= 17.4 Hz, H-24)，5.07 (1H, d,= 10.9 Hz, H-24)，1.11 (3H, s, H-25)，0.88 (3H, s, H-26)，2.66 (3H, s, H-28) (1)，分子质量为415 u。

1.2.1 细胞培养 HUVEC细胞在Eagle DMEM培养基中培养，添加体积分数10％胎牛血清（FBS）和体积分数1％青霉素-链霉素，并在含体积分数5%二氧化碳的培养箱中恒温37 ℃培养。

1.2.2 细胞活性实验 将HUVEC细胞接种在96孔板中培养，生长稳定后加入DMEM培养基和不同浓度的样品，浓度设置为0、1、5和10 µmol/L。继续在二氧化碳培养箱中培养24 h。弃其上清，用PBS润洗细胞后加入10 µL的CCK-8溶液，37 ℃避光培养1 h。用酶标仪检测每孔波长为450 nm时的值并记录分析。

1.2.3 细胞迁移实验 将HUVEC细胞接种在24孔板上培养，生长稳定后用200 µL的枪头在孔板中划出边缘整齐的伤口，用PBS溶液去除细胞碎片后，生长稳定后加入DMEM培养基和不同浓度的样品，浓度设置为0、1和10 µmol/L。分别于0、12 和24 h用显微镜对细胞向创面边缘迁移的情况进行拍照并记录分析。

1.2.4 Western blot 将HUVEC细胞在6孔板中培养，生长稳定后加入DMEM培养基和不同浓度的样品，浓度设置为0、1和10 µmol/L。1 h后加入10 µL的Ox-LDL（50 µg/mL）。设置空白组和阳性对照组，空白组中不加EAA和ox-LDL，阳性对照组不加EAA。培养24 h后弃其上清后，加入适量裂解液，将用细胞刮刀将细胞挂下，并在12 000 r/min，4℃离心15 min取上清液。BCA蛋白定量，并调整各组细胞培养上清液中的蛋白浓度。通过SDS-PAGE电泳后，根据蛋白分子大小将凝胶分切，置于NC膜上通过SDS-PAGE电泳进行蛋白印迹转移，在体积分数5%的脱脂牛奶中封闭2 h，用TBST清洗条带3次，每次10 min。分别加入对应的一抗溶液常温孵育4 h，用TBST清洗条带3次后加入对应的二抗溶液常温孵育2 h后再次清洗。利用全自动化学发光成像分析系统显色观察并拍照记录。分析系统分析读取条带面积、宽度和灰度值，做统计分析。

1.2.5 酶联免疫吸附 通过ELISA试剂盒测定HUVEC细胞中LOX-1蛋白的表达量。将HUVEC细胞在6孔板中培养，生长稳定后加入DMEM培养基和不同浓度的样品，浓度设置为0、1和10 µmol/L。1 h后加入10 µL的Ox-LDL（50 µg/mL）。设置空白组和阳性对照组，空白组不加EAA和ox-LDL，阳性对照组不加EAA。弃其上清后，加入PBS溶液，用细胞刮刀将细胞挂下，细胞悬浮液收集于无菌试管中反复冻融裂解蛋白后，12 000 r/min，4℃离心15 min得上清液，再根据试剂盒中的方案分析LOX-1蛋白的表达量。

1.2.6 血管生成实验 实验所用枪头和96孔板进行−20 ℃预冷，在冰上每孔加入60 µL基质胶，放入培养箱中静置30 min。将HUVEC悬液用细胞计数仪确定最终所需浓度（1 × 106cell/mL）后，每孔共加入EAA（0、1和10 µmol/L）和细胞悬液混合液200 µL，并设置一组阳性对照组，加入10 µLOx-LDL（50 µg/mL）。在培养箱培养4 h后用显微镜拍照记录。

1.2.7 ROS分析 将HUVEC细胞接种于24孔板中。生长稳定后加入DMEM培养基和不同浓度的样品，浓度设置为0、1和10 µmol/L。1 h后加入10 µL的Ox-LDL（50 µg/mL）。设置空白组和阳性对照组，空白组中不加EAA和ox-LDL，阳性对照组不加EAA。放入培养箱培养12 h。弃去旧培养基，用PBS缓冲溶液润洗细胞3次，加入200 µL DCFH-DA试剂(10 µmol/L)后置于37 ℃恒温培养箱中孵育30 min。于荧光倒置显微镜下观察并拍照记录分析。

1.2.8 分子对接 采用ChemBioDraw Ultra 14.0画出化合物EAA的结构（图1），然后用ChemBio3D Ultra 14.0转化为三维结构，并使用MMFF94力场进行优化。血凝素样氧化低密度脂蛋白受体（LOX-1）的三维结构从RCSB Protein Data Bank (www.rcsb.org)下载得到，选取LOX-1与其抑制剂Dioxane共晶的三维结构（PDB ID: 1YPQ）作为本课题对接所用的蛋白。LOX-1和化合物EAA均使用AutodockTools 1.5.6[20]转化为PDBQT格式。本研究采用Autodock vina 1.1.2[21]进行分子对接研究。根据配体Dioxane位置，确定LOX-1活性位点的坐标为：center_= 10.008，center_= 5.816，center_= 20.360；size_= 20，size_= 20，size_= 20。为增加计算准确度，将参数exhaustiveness设置为100。除特别说明，其他参数均采用默认值。最后，选取打分值最高的构象用PyMoL 1.7.6进行结果分析。

1.3 统计分析

采用Image J、Graphpad Prism 5.0软件进行数据处理分析及制图。所有实验结果以平均值±标准差表示，显著性差异使用单因素方差分析（one-way ANOVA分析）。与对照组相比，< 0.05代表有差异，< 0.01代表差异显著，< 0.001代表差异极显著。

2 实验结果

2.1 EAA对HUVEC细胞活力的影响

由图2可见，当EAA浓度为1、5和10 µmol/L时，与同条件下空白组相比，HUVEC的细胞活性均无显著差异（> 0.05）。该实验结果表明浓度为0～10 µmol/L的EAA对HUVEC在无细胞毒性作用，该浓度范围可进行后续活性探究，因此后续选用低浓度1 µmol/L和高浓度10 µmol/L进行活性研究。

2.2 EAA对HUVEC细胞中LOX-1和VEGF蛋白表达的影响

由图3、4可见，Ox-LDL可显著性诱导HUVEC细胞中受体蛋白LOX-1和血管生成关键蛋白VEGF的表达（< 0.01），而当EAA浓度为1、10 µmol/L时可以有效对其表达起到抑制作用（< 0.001），并且高浓度组的实验组抑制效果显著。因此可推论，EAA以剂量依赖方式减少HUVEC细胞中LOX-1和VEGF蛋白的表达及抑制Ox-LDL对细胞的影响。

阳性对照组不加EAA，处理组1加EAA 1 µmol/L及 Ox-LDL，处理组2加EAA 10 µmol/L及 Ox-LDL；与对照组相比* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001

阳性对照组不加EAA，处理组1加EAA 1 µmol/L及 Ox-LDL，处理组2加EAA 10 µmol/L及 Ox-LDL；与对照组相比* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001

2.3 EAA对HUVEC细胞中ROS活性氧的影响

由图6可见AA浓度为0 µmol/L时，荧光较少，而与空白组相比ox-LDL组显著诱导了HUVEC细胞的ROS水平（<0.001）。当EAA浓度为1、10 µmol/L时可有效对ROS的产生起到抑制作用（<0.001），且高浓度组的实验组抑制效果显著。该结果表明高浓度ETT以剂量依赖方式显著减轻了HUVEC中的ROS产生。

图5 HUVEC的ROS荧光图

阳性对照组不加EAA，处理组1加EAA 1 µmol/L及 Ox-LDL，处理组2加EAA 10 µmol/L及 Ox-LDL；与对照组相比* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001

2.4 EAA 对HUVEC细胞的迁移的影响

根据图8的细胞划痕实验结果分析，当EAA浓度为1、10 µmol/L时可以有效对细胞迁移起到抑制作用（< 0.001），并且高浓度组的实验组细胞的迁移被抑制的效果显著。根据12 h和24 h的对比可见，抑制效果可持续24 h，且效果随时间呈正比。结果表明EAA在细胞水平上具有抑制HUVEC细胞的迁移作用且是以剂量依赖的方式。

2.5 EAA对HUVEC细胞血管形成的影响

根据图9的血管形成实验图分析，EAA浓度为0 µmol/L时，HUVEC呈连接网状较多，而对照组中Ox-LDL显著性诱导HUVEC细胞的血管形成，细胞网状结构密集。EAA实验组的细胞集合明显少于空白组和对照组，HUVEC细胞主要呈单一分散排布的状态。该结果表明EAA以剂量依赖的方式抑制HUVEC细胞血管形成。

图7 EAA的细胞划痕图片

与空白组相比,* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001

图9 EAA对HUVEC的血管生成影响

2.6 EAA对HUVEC细胞中MAPK通s路表达影响

由图10和11免疫印迹条带结果分析，Ox-LDL可显著诱导HUVEC细胞MAPK通路蛋白的表达（<0.01），当EAA的浓度为1、10 µmol/L时可以有效对p38、JNK和ERK的磷酸化起到抑制作用（<0.001），并且高浓度组的实验组抑制效果显著。因此可推论，EAA以剂量依赖的方式减少HUVEC细胞中MAPK通路蛋白的表达及抑制其活性以达到抑制细胞迁移生长的作用。

“－”表示不添加，“＋”表示添加

阳性对照组不加EAA，处理组1加EAA 1 µmol/L及 Ox-LDL，处理组2加EAA 10 µmol/L及 Ox-LDL；与对照组相比* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001

2.7 EAA对HUVEC细胞中ICAM-1和VCAM-1蛋白表达的影响

由图12和13的蛋白免疫印迹条带结果分析，Ox-LDL可显著诱导HUVEC细胞ICAM-1和VCAM-1蛋白的表达（<0.01），当EAA浓度为1、10 µmol/L时可以有效对ICAM-1和VCAM-1蛋白表达起到抑制作用（<0.001），并且高浓度实验组抑制效果显著。因此可推论，EAA以剂量依赖的方式减少HUVEC细胞中ICAM-1和VCAM-1蛋白的表达以达到抑制动脉粥样硬化斑块形成作用。

“－”表示不添加，“＋”表示添加

阳性对照组不加EAA，处理组1加EAA 1 µmol/L及 Ox-LDL，处理组2加EAA 10 µmol/L及 Ox-LDL；与对照组相比* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001

2.8 EAA与LOX-1分子模拟对接

为从分子水平阐明LOX-1与化合物EAA的作用模式，将化合物EAA对接至LOX-1的活性口袋，其亲和力为-26.37 kJ/mol，理论结合模式如图14和15所示。由图14可以看出，化合物EAA的活性口袋中呈现出紧凑的结合模式。EAA处于一个由氨基酸Asp-147、Trp-148、Leu-157、Phe-158、Ser-159、Ser-160、Leu-175、Gln-193和Tyr-197所组成的腔袋，形成强烈的疏水性相互作用（图15）。EAA的可以与氨基酸Phe-158形成长为5.3×10-10m的氢键作用（图15），这是EAA和LOX-1之间最主要作用力。

图14 EAA对接至LOX-1的活性口袋的整体图

图15 EAA对接至LOX-1的活性口袋的细节图

总之，上述的分子对接研究对EAA和LOX-1的相互作用给予了合理的解释，为进一步研究LOX-1抑制剂奠定了基础。

3 讨论

动脉粥样硬化的发病机理十分复杂，主要涉及内皮细胞（ECs）、脂质代谢和血管平滑肌肉细胞（VSMC）。而在这些因素中，血管内皮细胞（VEC）损伤是动脉粥样硬化病变开始的早期步骤[22]。Ox-LDL通过多种机制促进动脉粥样硬化斑块的形成和进展，包括诱导内皮损伤、内皮细胞凋亡、巨噬细胞形成泡沫细胞和破坏抗氧化能力[2]。因此，本研究以Ox-LDL处理人脐静脉内皮细胞（HUVEC），引起内皮细胞损伤，研究EAA抗动脉粥样硬化疾病中血管生成病变的作用机制。有研究表明，LOX-1是Ox-LDL主要的内皮受体，可被Ox-LDL诱导引起过度表达，进而导致内皮激活和伤害，进而导致氧化和炎症反应，各种炎症介质和细胞因子不平衡表达[23-24]。本研究中EAA在无细胞毒性的基础上，能够抑制HUVEC细胞的迁移和血管生成行为，这说明EAA具有抗细胞转移和血管生成的潜力。同时，EAA能显著降低由Ox-LDL诱导的HUVEC细胞LOX-1和VEGF蛋白表达，因此EAA具有减少炎症反应和斑块内血管生成的活性。

细胞内积累过量的ROS被视为氧化应激的根本原因之一，ROS可促进动脉粥样硬化发展过程中内皮细胞凋亡和炎症因子的表达，进而引起炎症反应和功能障碍[25]。EAA能够降低由Ox-LDL诱导的HUVEC细胞ROS产生，减少内皮功能障碍和炎症反应发生的可能。黏附分子ICAM-1和VCAM-1是免疫球蛋白超家族（IGSF）的成员，是重要的一种炎症因子，能够促进炎症部位的黏连性[26]。MAPK通路是调节动脉粥样硬化中的关键通路之一，参与动脉粥样硬化炎症反应的调节，能够通过生长、炎症凋亡等多种方式调控细胞[27]。VEGF作为血管的有效促分裂原，是血管生成和内皮细胞的主要调节剂之一，MAPK信号通路同时也是VEGF的下游通路之一，能够被VEGF调节从而促进血管内皮细胞的增殖、侵袭和血管生成[9]。EAA表现出对MAPK信号通路、ICAM-1和VCAM-1蛋白表达具有显著的抑制作用，这些结果说明EAA能够通过抑制Ox-LDL诱导的炎症和血管新生，表现出优秀的抗动脉粥样硬化活性。分子对接结果显示，EAA与LOX-1产生稳定的氢键，具有相互作用，这表明EAA具有有效减少黏附分子、血管生成因子和炎症因子表达的活性。因实验条件，本研究没能对其他炎症通路和侵袭、血管生成通路进行验证，这将是今后进一步研究的重点。

4 结论

综上所述，海洋土曲霉代谢产物epi-aszonalenin A（EAA）能抑制氧化型低密度脂蛋白Ox-LDL诱导的HUVEC细胞中LOX-1、VEGF、MAPK信号通路、ICAM-1和VCAM-1蛋白表达，从而使HUVEC细胞炎症、迁移和血管生成得到抑制。分子对接预测分析进一步证实EAA与LOX-1具有稳定的结合位点。这为海洋土曲霉代谢产物EAA成为潜在动脉粥样硬化斑块血管生成预防功能性产品或治疗药物提供理论依据。

[1] LIBBY P. Atherosclerosis in inflammation[J]. Nature, 2002, 420(6917): 868-874.

[2] PIRILLO A, NORATA G D, CATAPANO A L. LOX-1, OxLDL, and atherosclerosis[J]. Mediators of Inflammation, 2013(24): 152786.

[3] SAWAMURA T, KUME N, AOYAMA T, et al. An endothelial receptor for oxidized low-density lipoprotein[J]. Nature, 1997, 386(6620): 73-77.

[4] AKHMEDOV A, ROZENBERG I, PANENI F, et al. Endothelial overexpression of LOX-1 increases plaque formation and promotes atherosclerosis[J]. European Heart Journal, 2014, 35(40): 2839-2848.

[5] JUN J, REINKE C, BEDJA D, et al. Effect of intermittent hypoxia on atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice[J]. Atherosclerosis, 2010, 209(2): 381-386.

[6] FERRARA N, GERBER H P, LECOUTER J. The biology of VEGF and its receptors[J]. Nature Medicine, 2003, 9(6): 669-676.

[7] AOKI K, WATANABE K, SATO M, et al. Effects of rhizoxin, a microbial angiogenesis inhibitor, on angiogenic endothelial cell functions[J]. European Journal of Pharmacology, 2003, 459(2/3): 131-138.

[8] MORENO P R, PURUSHOTHAMAN K R, ZIAS E, et al. Neovascularization in human atherosclerosis[J]. Current Molecular Medicine, 2006, 6(5): 457-477.

[9] PRADHAN R, SINGHVI G, DUBEY S K, et al. MAPK pathway: a potential target for the treatment of non-small-cell lung carcinoma[J]. Future Medicinal Chemistry, 2019, 11(8): 793-795.

[10] 毛洋, 刘小琼, 王洪梅, 等. 细胞间黏附分子1、血管细胞黏附分子1促进兔动脉粥样硬化斑块内血管新生[J]. 中国动脉硬化杂志, 2014, 22(3): 217-222.

[11] KOLODGIE F D, GOLD H K, BURKE A P, et al. Intraplaque hemorrhage and progression of coronary atheroma[J]. The New England Journal of Medicine, 2003, 349(24): 2316-2325.

[12] PARMA L, BAGANHA F, QUAX P H A, et al. Plaque angiogenesis and intraplaque hemorrhage in atherosclerosis[J]. European Journal of Pharmacology, 2017, 816: 107-115.

[13] MAUREA N, COPPOLA C, PISCOPO G, et al. Pathophysiology of cardiotoxicity from target therapy and angiogenesis inhibitors[J]. Journal of Cardiovascular Medicine (Hagerstown, Md), 2016, 17(Suppl 1 Special issue on Cardiotoxicity from Antiblastic Drugs and Cardioprotection): e19-e26.

[14] TOCCHETTI C G, GALLUCCI G, COPPOLA C, et al. The emerging issue of cardiac dysfunction induced by antineoplastic angiogenesis inhibitors[J]. European Journal of Heart Failure, 2013, 15(5): 482-489.

[15] SCHUEFFLER A, ANKE T. Fungal natural products in research and development[J]. Natural Product Reports, 2014, 31(10): 1425-1448.

[16] 杨静明, 杨文聪, 刘亚月, 等. 化学诱导对一株海洋来源土曲霉C23-3次生代谢产物及其生物活性的影响[J]. 微生物学通报, 2019, 46(3): 441-452.

[17] ZHANG Y Y, ZHANG Y, YAO Y B, et al. Butyrolactone-I from coral-derived fungusattenuates neuro-inflammatory response via suppression of NF-κB pathway in BV-2 cells[J]. Marine Drugs, 2018, 16(6): E202.

[18] GUO F, LI Z L, XU X W, et al. Butenolide derivatives from the plant endophytic fungus[J]. Fitoterapia, 2016, 113: 44-50.

[19] RANK C, PHIPPS R K, HARRIS P, et al. Epi-Aszonalenins A, B, and C from[J]. Tetrahedron Letters, 2006, 47(34): 6099-6102.

[20] MORRIS G M, HUEY R, LINDSTROM W, et al. AutoDock4 and AutoDockTools4: Automated docking with selective receptor flexibility[J]. Journal of Computational Chemistry, 2009, 30(16): 2785-2791.

[21] TROTT O, OLSON A J. AutoDock Vina: improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization, and multithreading[J]. Journal of Computational Chemistry, 2010, 31(2): 455-461.

[12] WANG T, BUTANY J. Pathogenesis of atherosclerosis[J]. Diagnostic Histopathology, 2017, 23(11): 473-478.

[23] SAWAMURA T, KAKUTANI M, CHEN M Y, et al. LOX-1, an endothelial receptor for oxidized LDL Implications for induction of endothelium dysfunction in the pathogenesis of vascular diseases[C]//Lipoprotein Metabolism and Atherogenesis, 2000: 45:193-198.

[24] KATTOOR A J, KANURI S H, MEHTA J L. Role of ox-LDL and LOX-1 in atherogenesis[J]. Current Medicinal Chemistry, 2019, 26(9): 1693-1700.

[25] KATTOOR A J, POTHINENI N V K, PALAGIRI D, et al. Oxidative stress in atherosclerosis[J]. Current Atherosclerosis Reports, 2017, 19(11): 42.

[26] HUBBARD A K, ROTHLEIN R. Intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) expression and cell signaling cascades[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2000, 28(9): 1379-1386.

[27] MAO J J, LIU J T, PANG X M, et al. Nicotine induces the expression of C-reactive protein via MAPK-dependent signal pathway in U937 macrophages[J]. Molecules and Cells, 2012, 34(5): 457-461.

Activie Mechanism of Epi-aszonalenin A Derived fromC23-3 on Endothelial Cells

LIU Yi1, CHEN Min-qi2, ZHANG Yi2,3, QIAN Zhong-ji1,3,

（1./ 2.,,524088,; 3.,518120,）

【Objective】To analyze the effect of epi-aszonalenin A (EAA), a metabolite of coral-derived fungus, on angiogenesis in atherosclerotic plaques induced by oxidized low-density lipoprotein (ox-LDL).【Methods】CCK method was used to detect cell viability; DCFH-DA was used to detect ROS content; scratch test was used to analyze the migration ability of human umbilical vein endothelial cells(HUVEC); angiogenesis was used to detect tube capacity; ELISA kit was used to detect the LOX-1 and VEGF proteins; western blotting was used to detect the expression of MAPK pathway, ICAM-1, VCAM-1 proteins; Molecular docking was used to simulate the interaction of EAA with LOX-1 protein.【Results】CCK method showed that EAA had no significant toxic effect on HUVEC (> 0.05). Compared with the blank control, EAA significantly inhibited cell migration and angiogenesis. Compared with the control group, ETT concentration in the experimental group increased. ROS content decreased significantly (< 0.001). LOX-1 and VEGF the expression of phosphorylation of p38, JNK, and ERK in MAPK pathway and ICAM-1 and VCAM-1 decreased gradually (< 0.001). Moreover, it can form a stable interaction with LOX-1. 【Conclusion】EAA can clear ROS and inhibit the expression of inflammatory factors and angiogenesis in HUVEC.

; metabolite; human umbilical vein endothelial cell; angiogenesis; anti-inflammatory;human oxidized low density lipoprotein

R915

A

1673-9159（2022）01-0059-08

10.3969/j.issn.1673-9159.2022.01.009

刘怡，陈敏琪，张翼，等. 海洋土曲霉C23-3代谢产物epi-aszonalenin A对内皮细胞的活性机制[J]. 广东海洋大学学报，2022，42（1）：59-66.

2021-11-03

深圳市国际合作研究项目协同创新专项（GJHZ20190823111601682）；南海海洋生物医药资源研发公共服务平台项目（XM-202008-01B1）；广东省基础与应用基础研究基金（2020A1515011075）

刘怡（1998－），女，硕士研究生，研究方向为海洋活性物质研究与开发。E-mail：Sioney61@163.com

张翼（1978－），男，博士，教授，研究方向为海洋天然物化学。E-mail:hebeizhangyi@163.com

千忠吉（1978－），男，博士，副教授，研究方向为海洋生物活性物质的研究与利用。E-mail：zjqian78@163.com

（责任编辑：刘岭）