李 曦 吴 仲 代丽娜 李仕梅 王子明 许凌懿 孔 航

（贵州中医药大学第一附属医院麻醉科，贵阳 550001）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种慢性大肠黏膜炎症，尤其影响结肠和直肠，其特点为间歇性的复发，之后缓解，随后导致黏膜损伤［1-3］。UC 主要累及结肠和直肠的远端黏膜，导致结肠疼痛、溃疡、水肿、血性腹泻、液体和电解质减少以及体重减轻等症状［4-6］。持续性UC 增加结肠癌的风险，它是炎症性肠病（inflammatory bowel diseases，IBD）的主要类型之一，是环境和遗传因素相互作用的结果，导致免疫反应和肠道炎症［7-8］。UC 的发病率和流行率在全球范围内呈上升趋势，一项研究报告显示每10万人中有1.0至15.0例UC 患者［9］。UC的传统治疗方法包括5-氨基水杨酸、硫嘌呤和皮质类固醇［10-12］。免疫调节剂包括钙调磷酸酶抑制剂，如环孢菌素和他克莫司也被证明对UC 有益［3］。然而这些药物伴随着严重的副作用，治疗效果也不理想。因此，有必要寻找新的治疗药物来有效地控制UC 的症状和并发症。依托咪酯（Etomidate，Eto），是一种短效的非巴比妥酸盐类催眠药，与其他药物（如丙泊酚或咪达唑仑）相比，具有稳定心血管和减少呼吸抑制的优势［13-14］。因此多年来一直是低血压患者的首选诱导剂［15］。但使用Eto 也有一定的副作用，比如肌阵挛和肾上腺皮质功能抑制等不良反应［16］。研究表明丙泊酚和Eto 联合应用可有效降低机体应激反应和炎症反应，提高胃肠镜检过程中的安全性［17］。本文主要探究了Eto 对DNBS 诱导的UC大鼠氧化应激及炎症反应的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 Eto、2，4-二硝基苯磺酸（2，4-dinitrobenzene sulfonic acid，DNBS）购自美国Sigma公司；IL-6、IL-1β、TNF-α ELISA 试剂盒购自美国R&D 公司；抗Bax，Bcl-2 抗体购自英国Abcam 公司；抗NF-κB p65（p-P65）抗体及辣根酶（HRP）标记二抗购自上海赛信通生物试剂有限公司；Nanodrop 2000（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）；TUNEL 试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒购自北京索莱宝公司。

1.1.2 实验动物 40只健康SPF级Wistar大鼠，8～10周龄，平均体质量（200±20）g，购自中国食品药品检定研究所实验动物资源研究所，合格证号SCXK（京）2014-0013。将动物圈养在温度可控的房间中，光照时间为12 h，温度为22℃～24℃，湿度为50%～60%，标准的实验室食物和任意的自来水喂养，实验前饲养1周使动物适应环境条件。

1.2 方法

1.2.1 DNBS 结肠炎的诱导［18］禁食12 h 后，用10%氯胺酮（50 mg/kg）和2%二甲苯嗪（5 mg/kg）麻醉动物，将30 mg 的DNBS 溶解在250 μl 乙醇（50% v/v）中，在距每只动物肛门8 cm 处用聚四氟乙烯导管进行结肠内给药，并且倒置15 min，以防止DNBS 溶液逸出。对照组在同一环境下用0.9%生理盐水。造模完成后，每天对动物称重，并评估肛门或粪便中是否存在腹泻和血液，计算疾病活动指数（disease activity index，DAI）［19］。模型组DAI 若为对照组的2倍以上，视为造模成功。

1.2.2 给药和样品采集 40 只Wistar 大鼠随机分为5组（n=8），对照组、模型组（DNBS）和模型加药组（DNBS+Eto）3 个剂量组：1.5 mg/kg（低剂量）、3 mg/kg（中剂量）、6 mg/kg（高剂量）。除对照组外，其他4组按1.2.1方法造模后自由饮食饲养，第3 天根据DAI判断所有大鼠造模成功。造模成功后按药物剂量每天腹腔注射给药1 次，连续2 周。实验结束后，10%氯胺酮麻醉，腹主动脉取血，分离血清，-20℃保存；结肠组织样本一部分保存于-80℃，一部分保存于37%～40%甲醛水溶液中。

1.2.3 结肠黏膜损伤指数（colonic mucosal damage index，CMDI）的观测 将大鼠处死后，取出结肠段，清除脂肪和肠系膜，在纵向打开后，评估结肠黏膜损伤指数，评分范围为：0，正常结肠（无损伤）；1，轻度充血，无溃疡；2，有闪点的溃疡或小的炎症区，充血水肿；3，大的炎症区和＜1 cm 的溃疡；4，大面积组织损伤和＞1 cm的延伸。

1.2.4 结肠组织学观察及评分（histopathological score，HS）取大鼠结肠病变最明显的一段，将其浸入10%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，切片，HE 染色，光镜下观察结肠组织学变化并评分。HS评分标准为：0，大鼠结肠黏膜无水肿、溃疡；1，肠黏膜轻度水肿和炎症溃疡，病变在黏膜层；2，肠黏膜中度水肿和炎症溃疡，病变到达肌层；3，肠黏膜重度水肿和炎症溃疡，病变迁延至浆膜层。

1.2.5 TUNEL 凋亡染色 将石蜡包埋的切片在二甲苯中脱蜡，在分级乙醇系列中脱水，用0.1 mol/L柠檬酸缓冲液将石蜡包埋，然后在TUNEL 反应混合物中37℃避光孵育1 h。用PBS 冲洗3 次，每次5 min，在荧光显微镜下观察。

1.2.6 Western blot 取1.2.2 保存的大鼠结肠组织，提取总蛋白，用Nanodrop 2000 测量蛋白质浓度并调平后，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质，然后将其转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。之后，将膜用含有5%脱脂牛奶的TBST 缓冲液封闭2 h。然后，将膜与抗Bax（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）、ACTIN（1∶1 000）、p-P65 和P65（1∶1 000）4℃孵育过夜。TBST 洗涤3 次，并与HRP标记的二抗室温孵育2 h。使用增强的化学发光剂ECL及Quantity One软件分析蛋白条带的灰度值。

1.2.7 氧化应激指标检测 取1.2.2 收集的大鼠血清，利用SOD和MDA试剂盒按照说明书对大鼠血清SOD、MDA水平进行检测。

1.2.8 ELISA 实验 取1.2.2 收集的大鼠血清，按照ELISA 试剂盒说明书进行检测炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α的表达。

2 结果

2.1 Eto 可改善DNBS 诱导的UC 大鼠的体质量如图1 所示，模型组（DNBS 组）DAI 指数均值为2.05，远高于对照组DAI 指数0.07 的2 倍（P＜0.05），模型构建成功。与模型组（DNBS 组）相比，DNBS+Eto中、高剂量组随药物剂量增加DAI指数显著下降（P＜0.05），低剂量组DAI指数无明显变化。

图1 大鼠DAI评分Fig.1 Rat DAI score

2.2 Eto 可减轻UC 大鼠结肠组织的病变程度 如图2所示，对照组大鼠结肠未观察到组织学改变，模型组结肠黏膜下层出现跨壁坏死、肠隐窝萎缩、水肿糜烂和明显的白细胞浸润，CMDI 指数和HS 评分明显高于正常组（P＜0.05），与模型组相比，DNBS+Eto 中、高剂量给药组病变程度明显减轻，高剂量组结肠组织形态基本恢复正常，CMDI 和HS 评分呈剂量依赖性显著降低（P＜0.05），低剂量组差异无统计学意义。

图2 肉眼和镜下观察结肠组织病理状态Fig.2 Pathological state of colon tissue was observed by naked eye and microscope

2.3 Eto可抑制UC大鼠结肠组织细胞凋亡 如图3所示，与对照组相比，模型组细胞凋亡率和Bax/Bcl-2 显著上调（P＜0.05），与模型组相比，DNBS+Eto中、高剂量组随剂量增加，细胞凋亡率和Bax/Bcl-2显著下调（P＜0.05），低剂量组差异无统计学意义。

图3 结肠组织细胞凋亡检测Fig.3 Detection of apoptosis in colon tissue

2.4 Eto 可减轻UC 大鼠结肠组织的氧化应激损伤 如图4所示，与对照组相比，模型组SOD水平明显降低（P＜0.05），MDA 水平明显升高（P＜0.05）。与模型组相比，Eto 中、高剂量组SOD 水平随药物剂量增加而升高，MDA水平随药物剂量增加而降低（P＜0.05），Eto低剂量组SOD及MDA水平无明显变化。

图4 氧化指标检测Fig.4 Detection of oxidation indexes

2.5 Eto 可减弱UC 大鼠结肠组织的炎症反应 如图5 所示，模型组中IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平及p-P65表达均显著高于对照组（P＜0.05）。与模型组相比，Eto 中、高剂量组IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平及p-P65表达呈剂量依赖性显著下调（P＜0.05），Eto低剂量组差异无统计学意义。

图5 ELISA检测炎症因子水平及Western blot检测NF-κB磷酸化Fig.5 Levels of inflammatory factors detected by ELISA and phosphorylation of NF-κB detected by Western blot

3 讨论

如今，UC 的治疗方法不断发展，但可用疗法仅限于减轻症状和非特异性免疫调节剂［20］。因此，UC的治疗仍然是具有重大医疗需求的领域。ZHANG等［21］研究发现Eto 可通过降低脓毒症大鼠糖皮质激素的表达来抑制NF-κB 激活，表明Eto 具有抗炎功效。本研究利用DNBS 诱导的UC 大鼠体质量显著下降，DAI 指数、CMDI 指数、HS 评分明显升高，黏膜下层出现跨壁坏死、水肿糜烂和明显的炎症细胞浸润，与文献报道一致，提示造模成功［22］。给予Eto 3 mg/kg、6 mg/kg处理后，随药物剂量增加，UC 大鼠体质量呈现显著改善，DAI 指数、CMDI 指数、HS 评分明显下降，且病变程度明显减轻。因此，Eto 对DNBS诱导的大鼠UC具有明显的治疗作用。

Bcl-2 蛋白家族在细胞凋亡过程中起到关键的调控作用，其中Bcl-2 功能是抑制细胞凋亡，Bax 功能是促进细胞凋亡。研究发现，Bax/Bcl-2决定了细胞凋亡与否［23］。本研究中DNBS 诱导的UC 大鼠细胞凋亡率和Bax/Bcl-2 均显著上调，与模型组相比，Eto 中、高剂量组细胞凋亡率和Bax/Bcl-2 均显著下调。因此，Eto可抑制大鼠UC诱导的细胞凋亡。

氧化应激是由自由基或过氧化物增加所引起的一种机体反应。自由基产生的增加对膜磷脂产生细胞毒性作用，导致形成有毒产物，如MDA 广泛用于评估氧化应激［10］。而SOD 具有减少脂质过氧化和清除自由基的作用［24］。本研究中Eto 中、高剂量组中SOD含量较模型组显著增加，MDA 含量显著降低，提示Eto 通过抑制氧化应激保护UC 大鼠结肠组织。

UC的一个主要特征是高水平的促炎症介质，如细胞因子（TNF-α、IL-1β 和IL-6），进而导致慢性炎症、溃疡和结肠黏膜损伤、白细胞浸润［25］。TNF-α有助于上皮屏障的破坏，诱导上皮细胞的凋亡，IL-6参与中性粒细胞的募集和激活，加剧炎症性肠炎的炎症状态，IL-1β和IL-6过量产生可能导致肠道炎症加重和肠道运动障碍［20］。本研究中Eto 中、高剂量组可显著降低DNBS诱导的UC大鼠血清中IL-1β，IL-6和TNF-α 细胞因子的高表达，因此Eto 可通过抗炎保护UC 大鼠的结肠组织。NF-κB 作为一条经典的炎症信号通路，对诱发炎症有重要作用［26］。本研究发现UC 大鼠中p-P65 表达水平相较于对照组显著上调，与模型组相比，Eto 中、高剂量组中p-P65 表达水平显著下调。因此UC 大鼠确实通过NF-κB 诱导促炎细胞因子的产生来增强炎症反应，而Eto 通过下调NF-κB 来抑制炎症的早期阶段和多个促炎基因的上调，从而减轻DNBS诱导的结肠炎。

Eto 可通过增加GABA 能受体活性来抑制神经元兴奋性，防止炎症和应激反应的发生［27］。GABA受体已被证实在免疫细胞上存在，可降低外周巨噬细胞炎症因子的产生［28］。研究表明GABA 能够抑制过度自噬，有效增强肠道黏膜屏障功能，对实验性结肠炎具有治疗作用［29］。因此Eto 对DNBS 诱导的UC 大鼠保护机制可能是通过激活GABA 能受体活性介导的，下一步可通过非Eto类GABA能激动剂进一步证实。总之，本研究表明Eto对DNBS诱导的大鼠UC 有一定的保护作用，其机制可通过减少细胞凋亡，抑制氧化应激反应，抑制NF-κB 通路的激活来减少TNF-α 等炎症因子释放，从而减轻UC 炎症损伤，保护并促进结肠组织功能恢复。因此，本研究为临床上使用Eto 治疗UC 提供了更充分的实验依据。