顾燕妮 王 嵩 谢春毅

（上海中医药大学附属上海市中西医结合医院，上海 200082）

随着全球社会经济的快速发展，人类生活环境、方式和老龄化等诸多方面发生了巨大的改变，糖尿病（diabetes mellitus，DM）发病率有较大的上升趋势［1］。糖尿病性心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是指DM 患者在排除冠状动脉疾病、高血压和心脏瓣膜疾病等情况下发生的心力衰竭，属DM 主要并发症之一［2］。目前DM的发病机制仍不明确，近期研究更倾向于DM是一种慢性炎症性疾病［3-4］。

活性氧（reactive oxygen species，ROS）是细胞内生理和病理的代谢产物，作为细胞信号传导分子参与细胞凋亡和炎症反应［5-6］。已有研究证明ROS 可激活下游c-Jun N-末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）信号通路［7］。JNK 是丝氨酸/苏氨酸激酶之一，属于丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）家族成员，它可以对各种应激反应产生应答，并促进炎症发生和细胞凋亡［8-9］。

红景天苷（salidrosides，SAL）是传统中药红景天的主要化学成分，本课题组的前期研究已证明，SAL可以抑制JNK 信号通路并改善DCM 大鼠心肌纤维化［10］。本次研究试图通过体外高糖心肌细胞（cardiomyocyte，CM）培养实验进一步探讨SAL 是否可通过减少ROS 从而抑制JNK 磷酸化及炎症水平，以探讨SAL对CM的药理作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 H9c2细胞由iCell（上海）生物技术股份有限公司提供（Lot：20200922）；DMEM 购自美国ThermoFisher科技（中国）有限公司（Lot：11885084）；胎牛血清购自美国Gemini Bioproducts LLC 公司（Lot：16000044）；胰蛋白酶购自北京索莱宝科技有限公司（Lot：20200624）；青霉素链霉素双抗（Lot：ST488）、过氧化物酶标记羊抗兔（Lot：A0277）和羊抗鼠二抗（Lot：A0286）均购自上海碧云天生物技术有限公司；SAL（Lot：FY1289B0510）购自南通经纬生物有限公司；JNK 抑制剂SP600125（Lot：420119）、JNK1/2（Lot：ab112501）和p-JNK1/2 抗 体（Lot：ab131499）试剂盒购自美国Abcam 公司（上海）贸易有限公司；CCK8 试剂盒（Lot：A16776）、Bax 抗体（Lot：A7626）均购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；ROS 试剂盒购自南京建成生物工程研究所（Lot：20201022）；GAPDH 抗体由美国Proteintech 集团有限公司提供（Lot：Ag0766）。ELISA 试剂盒和一般实验室耗材由上海基尔顿生物基因有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 H9c2细胞培养于含10%胎牛血清、100 U/ml 青霉素和0.1 mg/ml 链霉素DMEM 培养基中，置于37℃、5%CO2培养箱中孵育。

1.2.2 确定高糖刺激的时间 采用胰酶消化方法，取对数期H9c2细胞制成细胞悬液，按5×104个/孔接种于96 孔板。每1 ml DMEM 培养液另加入葡萄糖至终浓度为33.3 mmol/L（高糖），分别培养48 h、72 h 和96 h，每组设3 个复孔。培养结束后每孔加入CCK8 试剂10 μl，放入培养箱孵育3 h 后，用酶标仪450 nm 处测定各孔吸光值，计算细胞活性。细胞活性=（实验组-空白组）/（对照组-空白组）×100%。与普通DMEM 培养液H9c2 细胞比较，以细胞活性最小值确定为高糖诱导CM受损刺激时间。

1.2.3 确定SAL浓度 将H9c2细胞按5×104个/孔接种于96 孔板。在DMEM 培养液中分别加入0、5、10、20、40、80 μmol/L浓度的SAL，培养4 h后加入高浓度葡萄糖，调整DMEM 培养液中葡萄糖终浓度至33.3 mmol/L，继续培养96 h 后，用CCK8 试剂盒测定细胞活性。以细胞活性最大值确定SAL 有效浓度。

1.2.4 H9c2细胞培养实验分组 取对数期生长细胞融合度达70%～80%的H9c2 细胞，换无血清培养液培养24 h 后，将H9c2 细胞分为5 组。培养于普通DMEM 培养液（5.6 mmol/L 葡萄糖和27.7 mmol/L 20%甘露醇）的H9c2 细胞为对照组（C 组）；含33.3 mmol/L 高浓度葡萄糖DMEM 培养液的H9c2细胞为高糖组（HG 组）；高糖DMEM 培养液中加入10 μmol/L SAL为红景天苷组（SAL组）；高糖DMEM培养液中加入10 μmol/L SP600125 为JNK 抑制剂组（SP组）；高糖DMEM培养液同时各加入10 μmol/L SAL 和SP600125 为联合干预组（SAL+SP 组）。各组H9c2细胞均在5%CO2、37℃细胞培养箱孵育96 h。

1.2.5 ROS 检测 ROS 的检测使用活性氧荧光探针（2，7-dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA）。细胞按1.2.4 分组以1×106个/孔接种于6 孔板，培养96 h 后，弃培养液，以1∶1 000 比例用无血清DMEM培养基稀释DCFH-DA，每孔加入稀释后DCFH-DA 1 ml，5%CO2、37℃细胞培养箱内孵育45 min。用胰酶消化细胞1 min，加入完全培养基终止消化，制成细胞悬液，1 000 r/min 离心5 min 收集细胞，PBS 洗涤1 次，离心收集细胞沉淀后用PBS 重悬细胞，通过检测DCF 荧光强度间接反映细胞氧化应激的程度。使用流式细胞仪检测各组H9c2细胞平均荧光强度。

1.2.6 Western blot 检测 Western blot 方法检测细胞中Bcl-2、Bax、JNK1/2 和p-JNK1/2 蛋白表达水平。各组细胞以1×106个/孔接种于6 孔板，培养96 h。收集细胞沉淀，加入细胞裂解液，冰上裂解细胞，并提取细胞总蛋白，采用BCA 法进行蛋白定量。然后进行SDS-PAGE 凝胶电泳，半干法转膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，分别加入各自特异性一抗，4℃孵育过夜，各种抗体稀释比例分别为：Bcl-2 抗体1∶500、Bax 和JNK1/2 抗体1∶1 000、p-JNK1/2 抗体1∶2 000 和GAPDH 抗体1∶5 000。TBST 洗膜，加入荧光二抗，室温孵育1 h，以电化学发光法（ECL）显影。Image J 软件分析各条带灰度值，计算蛋白的相对表达量。

1.2.7 ELISA 检测 各组细胞培养按1×106个/孔接种于6 孔板，收集细胞上清液1 ml，分别放入干净1.5 ml尖底管，并随即放入-20℃保存，3 h后置-80℃深低温冰箱保存备测。IL-6和TNF-α检测采用美国Abcam 公司的已包被抗体的96 孔板。检测前在室温条件下解冻细胞培养上清液标本，4 000 r/min 离心10 min，弃沉淀。每孔加入标准品或待测上清液标本50 μl，后每孔加入抗体混合物50 μl，密封后置于400 r/min的平板振荡器上，在室温下孵育60 min。经洗涤，拍干，随后每孔加入100 μl TMB 显影液，在400 r/min 的平板振荡器上孵育10 min。加入终止液后，再振荡10 min，记录450 nm的吸光度。

1.3 统计学方法 采用SPSS21.0软件进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），组内两两比较采用LSD-t检验。所有检验结果以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 高糖刺激时间对H9c2细胞活性的影响 设普通DMEM 培养液孵育H9c2 细胞0 h 为对照组。与对照组比较，高糖DMEM 培养液孵育48 h 和72 h，H9c2 细胞活性未下降（P＞0.05）；高糖培养液孵育H9c2 细胞96 h 后，细胞活性显著下降，差异有统计学意义（P=0.014）。因此，后续实验确定采用高糖培养液诱导H9c2细胞活性下降的有效时间为96 h。H9c2细胞活性检测结果见表1。

表1 高糖不同刺激时间对H9c2细胞活性的影响（，n=3）Tab.1 Effect of different time of high glucose induction on viability of H9c2 cell lines（，n=3）

表1 高糖不同刺激时间对H9c2细胞活性的影响（，n=3）Tab.1 Effect of different time of high glucose induction on viability of H9c2 cell lines（，n=3）

2.2 SAL 浓度对细胞活性的影响 SAL 5、10、20、40 和80 μmol/L 预处理H9c2 细胞，并给予高糖培养液诱导刺激96 h 后，细胞活性均高于未予SAL 处理的对照组，差异具有统计学意义（P＜0.01）。其中使用10 μmol/L SAL组，H9c2细胞活性最高，与加入不同浓度SAL 的其他各组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。因此，后续实验SAL 的有效浓度均采用10 μmol/L。不同SAL浓度对高糖刺激H9c2细胞活性的影响见表2。

表2 不同SAL浓度对H9c2细胞活性的影响（，n=3）Tab.2 Effects of different SAL concentrations on viability of H9c2 cell lines（，n=3）

表2 不同SAL浓度对H9c2细胞活性的影响（，n=3）Tab.2 Effects of different SAL concentrations on viability of H9c2 cell lines（，n=3）

2.3 SAL 可降低高糖诱导H9c2细胞的氧化应激水平 与对照组比较，其他各组DCF 荧光强度均增高，具有统计学差异（P＜0.05）。与HG 组相比，SAL组与SAL+SP 组的DCF 荧光强度均明显降低，具有显著统计学差异（P＜0.01）；但SP 组对ROS 产生无显著抑制作用，H9c2细胞平均DCF荧光强度虽有下降趋势，但差异无统计学意义（P=0.234）。结果表明，暴露于高糖环境的H9c2 细胞ROS 水平增高，SAL 可有效降低高糖诱导的ROS 产生，而JNK 抑制剂对高糖诱导的H9c2 细胞ROS 产生无明显抑制作用。流式细胞术检测高糖诱导的H9c2 细胞ROS 结果见表3、图1。

图1 SAL对高糖诱导的H9c2细胞ROS水平的影响Fig.1 Effect of SAL on ROS production in H9c2 cardiomyocytes induced by high glucose

表3 SAL 对高糖诱导的H9c2 细胞ROS 水平的影响（，n=3）Tab.3 Effect of SAL on ROS production in H9c2 cells induced by high glucose（，n=3）

表3 SAL 对高糖诱导的H9c2 细胞ROS 水平的影响（，n=3）Tab.3 Effect of SAL on ROS production in H9c2 cells induced by high glucose（，n=3）

2.4 SAL 可抑制JNK 磷酸化 高糖诱导的H9c2 细胞的JNK 和p-JNK 表达水平均明显上调，与C 组比较均具有统计学差异（P＜0.01）；与HG 组比较，SAL组p-JNK表达下调，并具有统计学差异（P＜0.05），而JNK 表达虽有下降，但无统计学意义（P=0.137）；SP600125 可显著降低p-JNK 表达水平（P＜0.01），同时也抑制了JNK 的表达（P＜0.05）；而SAL+SP 组结果显示，p-JNK 和JNK 表达水平均显著下调（P均＜0.01）。表明SAL具有类似于JNK抑制剂的作用，可以阻止JNK 磷酸化。SAL抑制JNK 磷酸化表达结果见表4、图2。

图2 SAL对暴露于高糖环境中H9c2细胞JNK和p-JNK表达水平的影响Fig.2 Effects of SAL on expression levels of JNK and p-JNK in H9c2 cells induced by high glucose

表4 SAL对暴露于高糖环境中H9c2细胞JNK和p-JNK表达水平的影响（，n=3）Tab.4 Effects of SAL on expression levels of JNK and p-JNK in H9c2 cells induced by high glucose（，n=3）

表4 SAL对暴露于高糖环境中H9c2细胞JNK和p-JNK表达水平的影响（，n=3）Tab.4 Effects of SAL on expression levels of JNK and p-JNK in H9c2 cells induced by high glucose（，n=3）

2.5 SAL 可降低高糖诱导的H9c2 细胞炎症反应表5 显示高糖诱导H9c2 细胞IL-6 和TNF-α 的表达结果。与对照组比较，HG 组H9c2 细胞IL-6 和TNF-α 表达水平均显著升高（P＜0.01）。与HG 组比较，SAL组、SP组和SAL+SP 组干预后，IL-6和TNF-α表达均显著下调（P＜0.01），而SAL+SP 组对IL-6 的抑制效应更为显著，提示SAL 和JNK 抑制剂联合使用可能对前炎症因子具有更为强大的抑制作用。而SAL 组与SP 组对前炎症因子的抑制作用基本等同，说明在抑制高糖诱导的CM 炎症方面SAL 与JNK抑制剂的作用可能是等效的。

表5 SAL对高糖诱导的H9c2细胞IL-6和TNF-α表达水平的影响（，n=3）Tab.5 Effect of SAL on IL-6 and TNF-α expressions in H9c2 cells cultured under high glucose circumstance（，n=3）

表5 SAL对高糖诱导的H9c2细胞IL-6和TNF-α表达水平的影响（，n=3）Tab.5 Effect of SAL on IL-6 and TNF-α expressions in H9c2 cells cultured under high glucose circumstance（，n=3）

2.6 SAL 可下调Bax 表达并抑制H9c2 细胞凋亡表6 显示了SAL 对高糖诱导的H9c2 细胞中Bcl-2和Bax 表达水平。与对照组相比，高糖DMEM 培养液诱导的H9c2 细胞内Bcl-2 表达显著下调，Bax 表达显著上调（P＜0.01），Bcl-2/Bax 比值显著降低（P＜0.01）。与HG 组相比，SAL 组和SP 组Bcl-2 表达水平存在增高趋势，但差异无统计学意义（P分别为0.265和0.08），而Bax表达水平明显下调（P＜0.05）；SAL 组Bcl-2/Bax 升高（P＜0.05），而SP600125 可显著提高该比值（P＜0.01）；SAL+SP 组联合干预后，H9c2 细胞Bcl-2 表达增高（P＜0.05），Bax 表达显著下降（P＜0.01），且Bcl-2和Bax表达水平与正常对照组结果接近（P＞0.05），同时Bcl-2/Bax 升高（P＜0.01）。结果表明，SAL和JNK 抑制剂主要是通过下调Bax 表达水平，提高Bcl-2/Bax，而SAL+SP 联合干预组既可增强Bcl-2 的表达，同时又可抑制Bax 的表达，联合干预可能更有利于减少CM细胞凋亡。

表6 SAL对高糖诱导的H9c2细胞Bcl-2和Bax表达水平的影响（，n=3）Tab.6 Effect of SAL on Bcl-2 and Bax expressions in H9c2 cells cultured in high glucose condition（，n=3）

表6 SAL对高糖诱导的H9c2细胞Bcl-2和Bax表达水平的影响（，n=3）Tab.6 Effect of SAL on Bcl-2 and Bax expressions in H9c2 cells cultured in high glucose condition（，n=3）

图3 SAL对高糖诱导的H9c2细胞Bcl-2和Bax表达水平的影响Fig.3 Effect of SAL on Bcl-2 and Bax expressions in H9c2 cells cultured in high glucose condition

3 讨论

DCM 是DC 的常见并发症之一，DCM 潜在的病理改变包括炎症发生、葡萄糖/脂肪酸代谢紊乱和钙信号传导异常等，最终导致心肌纤维化和心肌肥大［11］。H9c2细胞是高糖诱导的CM损伤最常用的实验细胞株［12］。多个研究指出，与暴露于5.5 mmol/L葡萄糖浓度相比，高糖可使H9c2 细胞面积增大，提示高糖可诱导CM 肥厚［13-14］。因此，本实验也采用相同实验方法模拟DCM的心肌损害。

红景天是传统中草药，为景天科植物红景天Rholiolarosea Limn.或大花红景天R.euryphylla（Frod.）S.H.Fu.的根茎。归肺、心经，具有健脾益气，清肺止咳，活血化瘀的功效。《神农本草经》将红景天列为上品，记载“景天，味苦平。主大热，火疮，身热烦，邪恶气……”。《本草纲目》记载“红景天，本经上品，祛邪恶气，补诸不足”。SAL 为红景天的重要化学成分，而中草药很大一部分功能是免疫调节。红景天已广泛用于中医辨证为心血瘀阻证的疾病，其主要功效为活血化瘀，近年来也较多用于DM 和DCM。SAL 对心脏可能具有保护作用，可通过抗氧化以及抑制自由基保护CM。体内、外实验均表明SAL 可以减轻脂多糖诱导的大鼠心肌炎症［15］。刘晓丹等［16］研究发现，SD 大鼠心肌缺血-再灌注损伤模型给予SAL后CM凋亡率下降。

ROS 在细胞信号传递中发挥重要作用，过多产生ROS 可对机体造成损伤［17］。胰岛素抵抗以及细胞内高糖可使CM 产生过量的ROS，可能是DM 导致心肌损害的发病机制之一［18］。本次研究结果发现H9c2 细胞暴露于高糖环境后，ROS 水平显著升高，SAL 以及SAL 和JNK 抑制剂联合干预可有效抑制H9c2 细胞ROS 的产生。这表明SAL 重要的作用之一是抑制高糖诱导的ROS。已有多个研究表明JNK信号通路是ROS 重要的下游信号，ROS 可通过激活JNK 并促进细胞凋亡［7，19］。本次研究中也发现JNK抑制剂对高糖诱导的ROS表达无明显影响。

本次研究结果表明在高糖诱导H9c2 细胞中JNK 和p-JNK 表达均显著上调，SAL 干预可抑制高糖诱导p-JNK 表达，重复了本课题组先前实验的结果［10］。而联合使用SAL 和JNK 抑制剂对p-JNK 和JNK 表达抑制作用更为显著。SAL 可降低JNK 磷酸化水平，抑制JNK信号通路。

炎症反应在DCM 的病变中有重要作用。研究表明高血糖激活TLR4 诱导心脏炎症引起DCM 病变［20］。王丽萍等［21］研究证实，DCM 大鼠外周血中前炎症因子IL-6和TNF-α表达水平增高。而SHARMA等［22］的研究提出，TNF-α 可降低肌肉组织对胰岛素的敏感性，抑制TNF-α 和IL-6可保护DCM 大鼠心肌损害。本次实验发现，暴露于高糖环境H9c2 细胞TNF-α 和IL-6 显著增高，与王丽萍等［21］研究结果一致。SAL 和JNK 抑制剂都可显著抑制TNF-α 和IL-6的表达，且都表现为对IL-6 分泌的抑制作用更为显著。

大多研究表明，DCM 病程进展中CM 凋亡增加。MALEK 等［23］发现替米沙坦（telmisartan）和脑啡肽酶抑制剂塞奥芬（thiorphan）联合治疗可以改善链脲佐霉素（streptozocin，STZ）诱导的DCM 大鼠模型的左室功能障碍，并减少CM 凋亡。该研究指出，抑制CM 凋亡可能是预防DM 心脏病变的有效干预措施。WANG 等［24］发现尼可地尔（nicorandil）虽不能降低DCM 大鼠的血糖，但是可以缓解心肌肥厚，可能与降低CM凋亡率有关。正常机体中，抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax处于平衡状态。应激状态下，Bcl-2表达抑制可促进细胞内源性凋亡。因此，Bcl-2/Bax也可用于表达细胞存活和凋亡的水平［25-26］。本研究结果提示，SAL 和JNK 抑制剂都可上调高糖诱导的H9c2细胞的Bcl-2表达，但作用并不显著（P=0.265），而对下调Bax 的表达和提高Bcl-2/Bax 有显著作用（P＜0.05）。SAL 和JNK 抑制剂联合干预后，对高糖诱导的H9c2 细胞Bcl-2 和Bax 都有调节作用，表明SAL具有类似于JNK抑制剂作用。

体外CM 培养实验表明，高糖可诱导CM 产生过量ROS，ROS 可激活JNK 信号通路，导致CM 炎症发生和凋亡增加。SAL 具有抑制高糖诱导的CM 产生ROS，并减少JNK 信号通路激活，降低CM 产生前炎症因子以及细胞凋亡。因此，SAL 具有CM 保护作用，主要与抗炎和抗氧化特性有关，这可能是SAL对保护DM 过程中心脏病变的分子机制之一，有待今后DM 动物实验中进一步证实其对CM 治疗作用。JNK 抑制剂并不具备抗氧化作用，但与SAL 联合干预的叠加效应也有待进一步研究。