庄渊钊 颜景佳 谢文钦 谢文吉 王一雄

（福建省泉州市第一医院，福建医科大学附属泉州第一医院麻醉科，泉州 362000）

溃疡性结肠炎是一种弥漫性炎症疾病，临床表现为反复腹痛、腹泻及血便等，还可能伴有发热、体重减轻等全身症状，具有明显慢性疾病特点——疾病复发和缓解频繁交替，严重可能危及肝脏、皮肤、视觉等器官［1-2］。临床观察发现，长期存在广泛病变的溃疡性结肠炎患者，具有较高的结直肠癌发病风险［3］。目前，对于溃疡性结肠炎的病因尚未明确，可能是遗传、环境及免疫等多因素相互作用引起的［4］。临床常用氨基水杨酸制剂、糖皮质激素、免疫调节剂等药物治疗，但整体疗效不甚理想［5］。右美托咪定（dexmedetomidine，Dex）是一种α2肾上腺素能受体激动剂，是临床上常用的麻醉药物。近年来研究发现，Dex 具有抗炎作用，对多种器官炎症损伤有保护作用［6-7］。GUL 等［8］研究显示，Dex 对炎症性肠病有较好的改善作用。NLRP3 炎症小体具有强大的促炎作用，参与固有免疫调节。据报道，NLRP3 炎症小体参与炎症性肠病的发生发展［9］。因此，本研究通过观察不同剂量Dex 对2，4，6-三硝基苯磺酸（2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS）诱导的结肠炎大鼠的结肠组织、炎症介质分泌和NLRP3 炎症小体活化的影响，旨在探究Dex 在溃疡性结肠炎中的保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物来源 55 只SPF 级健康Wistar 雄性大鼠，6～8周龄，体重200～240 g，购于南京君科生物工程有限公司，动物许可证号：SCXK（苏）2019-0004。

1.1.2 药品与试剂 盐酸右美托咪定注射液购于宜昌人福药业有限责任公司，国药准字：H20183390，规格2 ml∶200 μg；TNBS购于美国Sigma；TUNEL 试剂盒购于武汉博士德生物；ELISA 试剂盒购于武汉华联科生物；髓过氧化物酶（MPO）检测试剂盒购于南京建成生物；蛋白抗体购于美国Cell Signaling；引物由上海碧云天生物合成。

1.1.3 仪器 光学显微镜（CX-31 型，日本Olympus）；酶标仪（RT-2100C，美国RAYTO）；实时荧光PCR仪（Lightcycler 480，瑞士Roche）。

1.2 方法

1.2.1 结肠炎大鼠模型的制备［10］采用TNBS/乙醇复合法制备结肠炎大鼠模型，具体操作如下：提前配制5%TNBS/乙醇复合液备用，禁食12 h 后，腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉大鼠，取塑料软管从大鼠肛门插入至结肠（约8 cm 处），注入5%TNBS/乙醇复合液0.8 ml，再将大鼠倒置15 min 后放回。模型大鼠在造模第2 天开始出现黏液脓血便，随机挑选3只模型大鼠，处死后剖取结肠组织，肉眼可见炎性损伤和溃疡，并做病理检查验证模型制备成功。

1.2.2 分组与处理 55 只Wistar 大鼠随机挑选10 只作健康对照组（Control），剩余大鼠采用TNBS诱导结肠炎大鼠模型，Control 组注入等量生理盐水。待模型稳定1 周后，将模型大鼠随机分为模型组和Dex 低、中、高剂量加药组，每组10 只。Dex 加药组腹腔分别注射12.5、25、50 μg/kg Dex，健康对照组和模型组以生理盐水替代［11］。

1.2.3 大鼠大体观察和样本采集 记录大鼠建模后精神状态、毛发、进食、体重及大便等情况，给药7 d后，禁食24 h，注射3%戊巴比妥钠麻醉大鼠，腹主动脉取血，2 000 r/min 离心10 min，取上层血清，并解剖距肛门8 cm处结肠组织，置于-80℃保存备用。

1.2.4 疾病活动指数的计算［12］根据大鼠体重变化、大便性状和便血情况，计算疾病活动指数评分（DAI），DAI=（体重下降分数+大便性状分数+便血分数）/3。其中体重改变为0 记0 分，下降1%～5%记1分，下降5%～10%记2分，下降10%～15%记3分，下降＞15%记4分；大便正常记0分，大便松散记2分，稀便记4分；无隐血或血便记0分，潜血阳性记2分，肉眼血便记4分。

1.2.5 结肠组织病理观察及评分［13］取结肠组织，沿肠系膜纵向剪开，向上展开黏膜，观察黏连、溃疡形成及炎症情况，计算结肠黏膜损伤指数评分（CMDI），其中无黏连记0 分，轻度记1 分，重度记2 分；无溃疡形成及炎症记0 分，局部充血但无溃疡记1分，1处溃疡不伴充血或肠壁增厚记2分，1处溃疡伴炎症记3分，CMDI评分为各项得分总和的1/2。取损伤明显处结肠组织制成石蜡切片，行常规HE染色，光镜下观察病理损伤变化，并根据炎症严重程度、炎症深度及隐窝损害，进行结肠组织学损伤评分（HS）。其中无炎症记0分，轻度记1分，中度记2 分，重度记3 分；炎症未浸润记0 分，浸润至黏膜记1 分，浸润至黏膜和黏膜下层记2 分，浸润全层记3 分；无隐窝损害记0 分，基底1/3 损坏记1 分，基底2/3 损坏记2 分，整个隐窝消失记3 分，HS 评分为各项得分总和的1/3。

1.2.6 TUNEL 染色观察结肠组织细胞凋亡 取结肠组织制成石蜡切片，脱蜡后水化，加入蛋白酶K溶液去除组织蛋白，加入含有2%过氧化氢的缓冲液，室温反应5 min，再滴加TdT 酶缓冲液，室温反应3 min，滴加TdT 酶反应液，37℃反应1 h，然后加入预热到37℃的洗涤与终止反应缓冲液，37℃反应30 min，再滴加过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，室温反应30 min，最后进行DAB 染色，苏木素复染，脱水、透明后封片。阳性细胞为细胞核中有棕黄色颗粒，光镜下随机挑选200倍视野，计数凋亡细胞。

1.2.7 ELISA 检测血清炎症因子含量 取血清样本解冻，放至室温后，参照ELISA 试剂盒说明书操作，检测大鼠血清促炎因子诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、TNF-α、IL-6和抗炎因子IL-4、IL-10的含量。

1.2.8 RT-PCR 检测结肠组织中炎症因子mRNA水平 取冰冻结肠组织，加入适量液氮研磨，再加入Trizol 溶液提取总RNA，溶解于DEPC 水中，检测其纯度、浓度和完整度，选用电泳条带完整、A260/A280为1.80～2.00 的样本进行反转录，取2 μl 反转录产物进行RT-PCR，扩增条件为：94℃35 s，57.5℃45 s，72℃45 s，共38 个循环。以GAPDH 为内参，计算炎症因子iNOS和IL-10 mRNA的相对表达量。

1.2.9 比色法检测结肠组织MPO 活性 取冰冻结肠组织，加入9 倍生理盐水冰上匀浆，3 000 r/min离心10 min，参照试剂盒（比色法）说明操作，检测结肠组织中MPO活性。

1.2.10 Western blot 检测结肠组织中相关蛋白表达 取冰冻结肠组织，加入适量液氮研磨，再加入细胞裂解液收集总蛋白，取洁净玻璃板配制10%SDS-PAGE 凝胶，每孔加入50 μg 蛋白样本，恒压110 V 下进行电泳，再将蛋白条带转移至PVDF膜，恒流300 mA下电转90 min，应用含有5%脱脂奶粉的缓冲液浸泡电转膜，室温下孵育1 h，添加蛋白一抗，其中半胱天冬酶3（Caspase-3，1∶1 000）、经切割 的Caspase-3（cleaved cas3，1∶1 000）、Caspase-9（1∶1 500）、cleaved cas9（1∶1 500）、NLRP3（1∶1 000）、耦联接头蛋白ASC（1∶500）、IL-1β（1∶1 000）、IL-18（1∶1 000）、内参GAPDH（1∶1 000）置于摇床中4℃放置过夜，次日添加HRP标记的蛋白二抗（1∶10 000）室温孵育30 min。

1.3 统计学处理 应用SPSS17.0软件进行统计学分析，数据以表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对大鼠体重的影响 如图1，对照组大鼠体重随着时间的推移，均呈持续增加趋势，但模型组和Dex 加药组建模后体重呈先下降再缓慢升高的变化趋势，至给药结束时，体重由轻到重依次为模型组、低、中、高剂量Dex加药组、健康对照组。

图1 各组大鼠体重的变化Fig.1 Changes in weight of rats in each group

2.2 对结肠组织病理学的影响 如图2，健康对照组大鼠结肠组织中肌层结构完整，上皮绒毛组织正常，无炎症细胞浸润；模型组上皮绒毛组织结构失常，肠黏膜内细胞排列紊乱，有大量炎症细胞浸润；与模型组相比，中、高剂量Dex加药组黏膜溃疡病变和炎症细胞浸润程度有明显改善。与健康对照组相比，模型组大鼠DAI、CMDI 和HS 评分均升高（P＜0.05）；与模型组相比，中、高剂量Dex加药组上述评分均降低（P＜0.05），见表1。

图2 光镜下结肠组织病理学形态（HE，×200）Fig.2 Pathological morphology of colon tissues under light microscope（HE，×200）

表1 Dex对大鼠DAI、CMDI和HS评分的影响（）Tab.1 Effects of Dex on DAI，CMDI and HS scores（）

表1 Dex对大鼠DAI、CMDI和HS评分的影响（）Tab.1 Effects of Dex on DAI，CMDI and HS scores（）

Note：Compared with healthy control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05.

2.3 对结肠组织细胞凋亡的影响 如图3，与健康对照组相比，模型组大鼠结肠组织中凋亡细胞率明显升高（P＜0.05）；与模型组相比，中、高剂量Dex 加药组凋亡细胞率明显降低（P＜0.05）。

图3 Dex对大鼠结肠组织细胞凋亡的影响Fig.3 Effects of Dex on apoptosis of colon tissues of rats

2.4 对结肠组织中凋亡标志物表达的影响 如图4，与健康对照组相比，模型组大鼠结肠组织中cleaved cas3/Caspase-3 和cleaved cas9/Caspase-9 水平上调（P＜0.05）；与模型组相比，中、高剂量Dex 加药组上述蛋白水平下调（P＜0.05）。

图4 Dex对大鼠结肠组织中凋亡标志物表达的影响Fig.4 Effects of Dex on expressions of apoptosis markers in colon tissues of rats

2.5 对大鼠炎症因子水平和结肠组织MPO 活性的影响 与健康对照组相比，模型组大鼠血清TNF-α、iNOS、IL-6、IL-10、IL-4和结肠组织iNOS、IL-10 mRNA、MPO 水平均升高（P＜0.05）；与模型组相比，中、高剂量Dex 加药组血清TNF-α、iNOS、IL-6 和结肠组织iNOS mRNA 和MPO 水平降低，血清IL-10、IL-4 和结肠组织IL-10 mRNA 水平升高（P＜0.05），见表2、图5。

表2 Dex对大鼠血清炎症因子水平和结肠组织MPO活性的影响（）Tab.2 Effects of Dex on levels of serum inflammatory factors and MPO activity in colon tissues of rats（）

表2 Dex对大鼠血清炎症因子水平和结肠组织MPO活性的影响（）Tab.2 Effects of Dex on levels of serum inflammatory factors and MPO activity in colon tissues of rats（）

图5 Dex对大鼠结肠组织中炎症因子mRNA表达的影响Fig.5 Effects of Dex on expressions of inflammatory factors mRNA in colon tissues of rats

2.6 对NLRP3炎症小体蛋白表达的影响 如图6，与健康对照组相比，模型组大鼠结肠组织中NLRP3、ASC、IL-1β及IL-18蛋白表达上调（P＜0.05）；与模型组相比，中、高剂量Dex加药组上述蛋白表达下调（P＜0.05）。

图6 Dex 对大鼠结肠组织中NLRP3 炎症小体蛋白表达的影响Fig.6 Effects of Dex on expressions of NLRP3 inflammasome proteins in colon tissues of rats

3 讨论

随着对溃疡性结肠炎病因病机研究的不断深入，普遍认为其病因为肠道菌群与黏膜免疫系统的失衡［14］。黏膜免疫系统是固有免疫的重要部分，属于免疫系统识别自我非我的第一道防线，主要通过细胞表面的模式识别受体识别内外环境中的各种刺激，以保证细胞环境的稳态。近年来，炎症调节通路在炎症相关疾病中的调控作用成为研究热点，如MAPK、NF-κB 通路等［15］。炎症小体是这些固有免疫调节通路的中心环节，由多种蛋白组合形成功能复合体，参与炎症相关疾病的发生发展［16］。各种模式识别受体都具有一个特殊结构域，可感受多种刺激分子，形成炎症小体，进一步激活MAPK、NFκB 通路促进炎症小体自身组分及前炎症因子的分泌与活化，发挥促炎及抗炎作用。

NLRP3 是目前研究最为广泛的炎症小体，主要由NLRP3、ASC 及pro-caspase-1 组成，效应过程中会激活下游 分子IL-1β 和IL-18 进行炎症调节［17］。LING 等［18］研究发现，NLRP3、ASC 及caspase-1 缺陷的小鼠在结肠炎中有保护作用。临床数据也显示，NLRP3 基因与结肠炎的易感性密切相关［19］。这些研究说明，NLRP3 炎症小体在结肠的形成过程发挥促炎作用。现有构建溃疡性结肠炎实验动物模型的方法较多，其中以TNBS/乙醇复合诱导法最常用，其主要致病机制为乙醇破坏肠黏膜屏障，TNBS浸润至结肠组织结合高分子物质，引起黏膜免疫应答和炎症反应，符合溃疡性结肠炎从急性期到慢性期的长期炎症演变过程［20］。MPO 主要存在于中性粒细胞，参与机体炎症反应。本研究结果显示，通过TNBS/乙醇复合诱导大鼠后，大鼠疾病活动指数、结肠黏膜大体形态和组织病理学评分明显增加，结肠组织中MPO 活性增加，NLRP3 炎症小体各组分表达及炎症因子水平上调，结肠组织细胞凋亡率显著升高，与既往研究结果相符［21］，提示结肠炎大鼠模型制备成功。

Dex 是临床理想的静脉麻醉药物，近年研究发现，Dex 对于感染、休克及缺血再灌注等引起的炎症反应均具有抗炎作用，但Dex 抗炎作用研究仍处于初级阶段［22］。张梦婕等［23］研究显示，腹腔注射Dex可减轻大鼠腹腔黏液，可能与激活胆碱能抗炎通路，减轻全身炎症反应有关。QIU 等［24］应用脂多糖刺激BV2 细胞建立神经炎症模型，发现Dex 预处理可介导MAPK/ERK 通路发挥抗炎作用。但Dex 在结肠炎中的抗炎机制尚不完全明确。本研究结果显示，中、高剂量Dex干预后一定程度上缓解了结肠炎的发展，结肠组织中MPO 活性、NLRP3 炎症小体成分及TNF-α、iNOS、IL-6、IL-1β 及IL-18 等强效促炎因子水平下调，抗炎因子IL-10 和IL-4 水平上调，提示中、高剂量Dex 可抑制NLRP3 炎症小体活化，调节其下游相关炎症因子水平，减少浸润至结肠组织中的炎症细胞，从而缓解TNBS 诱导的大鼠结肠炎。炎症反应引起的细胞损伤积累到一定程度会导致程序性细胞死亡，其中细胞凋亡是最为经典的形式，主要依赖caspase 家族蛋白的调控，其中Caspase-3 是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，Caspase-9 是凋亡信号的起始者，外界刺激下经切割的Caspase-9 将对执行者Caspase-3 进行切割并使之激活，最终导致细胞凋亡。TUNEL 染色证实，结肠炎大鼠结肠组织细胞有凋亡加速的现象，经Dex 干预后，细胞凋亡率下降，表明Dex可延缓结肠组织细胞凋亡，可能与抑制凋亡标志物Caspase-3、Caspase-9的活化有关。这与YANG 等［25］报道Dex 可下调Caspase-3水平抑制急性肝损伤的作用相似。

综上所述，本研究首次提出Dex 可能抑制NLRP3 炎症小体的活化，阻滞炎症介质的分泌，从而缓解TNBS 诱导的结肠炎。但这只是Dex 治疗结肠炎的初步机制探索，其详细作用靶点还有待深入分析。另外，在不同时期、不同严重程度的结肠炎模型中，NLRP3 炎症小体的详细作用机制还有待进一步探究。