汪玉磊 谭乂珉 李 波 尹国芳 范贤明

（西南医科大学附属医院呼吸与危重症医学科，炎症与变态反应实验室，泸州 646000）

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是肺组织弥漫性炎症反应，其中感染，尤其是革兰氏阴性菌细胞的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）引起的脓毒血症在ALI诱因中最为常见［1-2］。目前针对ALI虽然有很多治疗药物及方法，但寻找新的、有效的治疗方法仍然是ALI的研究热点。近年来多项研究已经证实肠肺轴的存在、肠道微生物群落与肺的各种疾病（如哮喘、慢性阻塞性肺疾病、囊性纤维化、感染等）的发生发展有关，而肺部疾病也会导致肠道微生物群落改变，影响肠黏膜结构和功能改变［3-4］。有研究发现肠缺血可通过TLR4/NF-κB 引发肺毛细血管膜损伤，导致ALI［5］。Toll 样受体4（TLR4）是一种跨膜受体，在启动免疫应答中起关键作用［6-7］。在ALI 早期受到LPS 刺激后就产生炎症反应，LPS 与TLR4 受体结合经过髓样分化因子（myeloid differentiation factor 88，MyD88）依赖途径激活核转录因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB），促进炎症细胞因子的表达和释放，导致炎症反应的失控诱导ALI［8-9］。先前的研究发现粪菌移植（fecal microbiota transplantation，FMT）可以改善LPS 诱导的ALI［10-11］，但其潜在机制仍然未知。本文通过腹腔注射LPS建立大鼠内毒素性ALI 模型，探究粪菌移植对TLR4/NF-κB 信号通路的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 LPS 购自美国Sigma 公司；IL-10 ELISA试剂盒购自上海科兴商贸有限公司；兔源性的GAPDH、MyD88、TLR4 均购自英国Abcam 公司；兔源性的NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65 购自美国Cell Signaling Technology；而HRP 标记山羊抗兔的二抗、BCA 试剂盒及兔二抗均购自武汉阿斯本生物技术有限公司；交由上海生物工程有限公司完成肠道菌群的高通道测序。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及创建模型 西南医科大学动物实验中心购入15只SD大鼠，适应性喂养1周。随机均分为3 组，分别为正常对照组（NS 组）、模型组（LPS 组）、干预组（FMT 组）。通过向LPS 组及FMT组腹腔内注射LPS（5 mg/kg）构建ALI 动物模型，NS组则注射等量无菌生理盐水。FMT 组经腹腔注射LPS 处理24 h 后进行粪菌移植处理（参照SUN 等［12］的制备方法提取粪菌液：收集健康对照大鼠新鲜的粪便沉淀物，将粪菌浸入无菌生理盐水中振荡15 min，6 000 r/min 离心15 min，去掉上清液，获得沉淀物并再次重复以上步骤2 次，最终得到的沉淀物与氯化钠溶液混合得到粪菌液）。采用管饲法给予FMT 组粪菌液灌胃（剂量为10 ml/kg，2 次/d，连续2 d）；NS 组和LPS 组则采用等量的氯化钠溶液。于干预结束24 h 后处死各组大鼠，收集大鼠标本用于后期检测。

1.2.2 血气分析 取大鼠的腹主动脉血在血气分析仪上行动脉血氧分压（PaO2）检测。

1.2.3 血清中炎症细胞因子的测定（ELISA 分析）抽取大鼠动脉血，静置1 h 后在离心机中高速离心（6 000 r/min 离心5 min）提取上清液，按ELISA试剂盒说明书检测血清IL-10的OD值。

1.2.4 组织病理学评价及免疫组化 取左肺组织，用多聚甲醛溶液固定，然后脱水并包埋在石蜡中，将石蜡包埋的组织切块，用苏木精-伊红染色法（HE）染色，在光学显微镜下观察肺组织病理损害，参照SU 等［13］评分方法，根据肺泡水肿、炎症细胞浸润、肺泡间壁增宽等指标进行肺损伤评分。按照损伤程度评0～4分（无损伤为0分、轻微为1分、中度为2 分、重度为3 分、极重度为4 分），各项评分之和为肺组织病理评分。

为了进行免疫组织化学评估，将石蜡切片进行脱蜡和水化，抗原修复，封闭，一抗孵育，二抗孵育，显色复染，封片。在显微镜下观察切片染色情况。免疫组化定量分析：在每张切片中任意选择3 个区域，检测每个视野阳性信号的灰度值。

1.2.5 肺湿/干重比（W/D）取3组大鼠新鲜右肺组织，首先称量得到肺湿重（W），然后将肺组织放置在70℃烤箱中烘烤72 h 至脱水后称重得到干重值（D），最后计算肺湿/干重（W/D）比值。

1.2.6 肺组织蛋白的收集及蛋白质印迹分析 取肺组织提取蛋白，并于BCA 试剂盒测定样品蛋白浓度，确定上样量后行SDS 聚丙烯酰胺电泳，300 mA恒流转膜，封闭后将膜与TLR4、p-NF-κB p65、NF-κB p65 的一抗孵育过夜，次日与二抗孵育，经洗膜后于暗室中曝光，将胶片进行存档，并进行半定量分析处理。

1.2.7 肠道菌群测序 收集大鼠粪便放入冻存管进行存放，提取粪便样品的总DNA，并检测DNA 样品纯度及浓度。然后使用通用引物对细菌16S rDNA V3～V4区进行PCR 扩增。最后采用MiSeq测序软件进行分析。

1.3 统计学分析 本实验结果采用SPSS17.0软件进行统计分析。各组数据以表示，首先采用正态检验和方差分析对各数据检验，各组间结果两两比较时，采用配对设计资料的Student'st检验，多组间数据分析时采用单因素的方差分析，当方差不齐时采用秩和检验（Kruskal-Wails）。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠氧分压 与NS 组相比，LPS 组PaO2明显降低（P＜0.05），而FMT 组PaO2较LPS 组明显上升（P＜0.05），见表1。

2.2 大鼠肺W/D 与NS 组比较，LPS 组大鼠肺W/D 显著升高，与LPS 组比较，FMT 组大鼠肺W/D显著降低（P＜0.05），见表1。

2.3 大鼠组织病理变化

2.3.1 肺组织的病理观察 LPS 组大鼠肺组织结构杂乱无章，肺泡间隔增宽，肺组织正常结构破坏；FMT 组大鼠肺泡中炎症细胞减少，肺泡壁变薄，肺泡结构破坏减轻（图1）。

图1 大鼠肺组织病理结构（HE，×200）Fig.1 Pathological changes of lung tissues of rats（HE，×200）

2.3.2 肺组织的病理评分 与NS 组相比，LPS 组肺组织病理评分明显增高，而FMT 组肺组织病理评分较LPS组明显降低（P＜0.05），见表1。

表1 大鼠氧分压、W/ D及肺组织病理损伤评分结果（）Tab.1 Lung tissue oxygen partial pressure，W/ D and lung tissue pathological injury score of each group（）

表1 大鼠氧分压、W/ D及肺组织病理损伤评分结果（）Tab.1 Lung tissue oxygen partial pressure，W/ D and lung tissue pathological injury score of each group（）

Note：PaO2.Partial pressure of arterial blood oxygen；LPS.Lipopolysaccharide；FMT.Fecal fungus transplantation.Compared with NS group，1）P＜0.05；compared with LPS group，2）P＜0.05.

2.4 大鼠血清IL-10 水平 与NS 组比较，LPS 组大鼠外周血清中抑炎因子IL-10 浓度下降（P＜0.05）；与LPS组比较，FMT组大鼠血清抑炎因子IL-10的浓度上升（P＜0.05），见表2。

2.5 大鼠TLR4/MyD88/NF-κB通路的结果

2.5.1 免疫组化检测MyD88 的变化 LPS 组肺泡上皮细胞MyD88 蛋白相对表达量显著高于对照组，FMT 组肺泡上皮细胞MyD88 表达阳性率显著低于LPS 组（P＜0.05），FMT 组和NS 组结果比较具有差异，但差异无统计学意义（P＞0.05），详见图2、表2。

图2 大鼠肺组织MyD88蛋白表达的免疫组化结果（×400）Fig.2 Immunohistochemical results of MyD88 protein expression in rat lung tissue（×400）

表2 大鼠血清IL-10含量及肺组织MyD88表达的情况（）Tab.2 Serum IL-10 content and MyD88 expression in lung tissue of rats（）

表2 大鼠血清IL-10含量及肺组织MyD88表达的情况（）Tab.2 Serum IL-10 content and MyD88 expression in lung tissue of rats（）

2.5.2 粪菌移植对TLR4/NF-κB 蛋白通路表达的影响 与NS 组比较，LPS 组大鼠肺组织中TLR4、p-NF-κB p65 表达水平显著升高（P＜0.05），与LPS组相比，FMT 组TLR4、p-NF-κB p65 表达水平降低（P＜0.05），见图3。各组NF-κB p65 总的表达量无明显变化。

图3 大鼠肺组织TLR4/NF-κB信号通路表达Fig.3 Expression of TLR4/NF-κB signaling pathway in rats lung tissue

2.6 各组大鼠肠道微生物的变化 基于α 和β 多样性指标对各组大鼠微生物菌群进行了分析：Chao与Ace 指数表示菌群的丰富度，其数值越大证明菌群拥有更高的丰富度，NS组和FMT组的肠道菌群的丰富度高于LPS 组，但差异无统计学意义（图4，P＞0.05）。本次各样本的测序覆盖率大于0.99，反映了各样品中未被检出的序列概率很低，表明其值可以真实反映样本中微生物的含量。

图4 各组大鼠肠道菌群Alpha结果分析Fig.4 Analysis of Alpha diversity of intestinal flora of rats in each group

Shannon 稀释曲线（rarefaction curve）可以用来比较测序数据量不同的样本中物种的丰富度。图5可看出LPS组肠道菌群的丰度小于NS组和FMT组。同时也说明样本数据量含量的合理性。

图5 各组大鼠Shannon指数稀疏曲线图Fig.5 Shannon rarefaction curve of rats in each group

主坐标分析（principalco-ordinates analysis，PCoA）各组样品之间的距离越接近则其菌落组成结构就越相似。PCoA 分析结果显示，LPS 组的离散程度最大，而经粪菌移植后的FMT 组和NS 组距离接近，表示FMT组的物种结构和NS组相似（图6）。

图6 主坐标分析Fig.6 Principal coordinate analysis

3 讨论

ALI 是一种常见的临床疾病，会导致肺泡毛细血管膜损伤，广泛的中性粒细胞浸润和炎症介质的释放［14］。越来越多的研究表明肠道中的微生物群落对机体免疫功能调节至关重要［15-16］。本研究通过大鼠腹腔注射LPS来复制急性损伤的模型。经腹腔注射LPS 的大鼠，肺组织出现肺泡间隙水肿及炎症细胞浸润，肺泡结构破坏，肺W/D明显增加，PaO2下降，肠道菌群多样性及丰富度下降；经FMT 后的大鼠肠道菌群的多样性及丰富度增加，菌群结构更稳定，同时其肺组织学、水肿程度、PaO2均得到了明显改善。以上证据表明LPS造成了大鼠的急性肺损伤及肠道微生物结构改变。FMT 可以在一定程度上纠正失调的肠道菌群，并对LPS 的急性肺损伤具有一定的保护作用。

TLR4被认为是哺乳动物LPS 的信号受体，参与炎症反应的发生发展，NF-κB 通路在调节炎症反应中起着核心作用［8］。NF-κB 信号通路激活后促进炎症因子（TNF-α、IL-6、IL-1β 等）过度释放，抗炎因子（IL-10）分泌不足，促炎因子和抗炎因子的失衡是造成ALI 的关键［7］。抗炎治疗是对抗ALI 的主要治疗方法，因此，寻求有效的抗炎药物来治疗ALI是目前的研究热点［9］。IL-10 是一种多功能的细胞因子，参与机体的炎症反应和免疫反应，是公认的炎症与免疫抑制因子，其可以调节炎症的严重程度，保护正常组织免受炎症损伤，在机体对抗感染的过程中发挥重要的保护作用［17］。其主要生物活性表现为可抑制单核巨噬细胞、中性粒细胞释放多种细胞因子，减少使白细胞聚集的炎症因子和黏附分子的产生，最终阻止炎症细胞活化并迁移到炎症部位［18-19］。研究发现IL-10 可改善肺部炎症并降低肺损伤的严重程度［20-21］。

本研究探讨LPS 诱导的ALI 大鼠中TLR4/MyD88/NF-κB 信号蛋白的表达。LPS 处理后，肠道菌群结构改变，肺组织中TLR4 和MyD88 蛋白的表达显著增加，磷酸化的NF-κB p65也被上调，血清中抗炎因子IL-10 分泌明显减少，因此TLR4 对LPS 的识别触发了MyD88 依赖性信号传导，诱导NF-κB 磷酸化，促进下游炎症因子大量释放，抑制抗炎因子分泌，炎症反应失衡导致ALI的发生发展，这与先前的研究结果类似［17，22］。但是经FMT后，大鼠肠道微生物群落结构改善，肺组织中TLR4、MyD88、p-NF-κB p65 的表达下调，促进抗炎因子IL-10 分泌，并发挥其抗炎作用。本团队已证实FMT后的ALI大鼠血清中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β 分泌明显减少［11］。本研究结果表明肠道微生物可能通过下调TLR4/MyD88 信号传导有效抑制NF-κB p65 的活化，促进抗炎因子IL-10 的分泌，从而抑制白细胞的聚集，减少TNF-α、IL-1β、IL-6 等炎症因子的产生，保护肺组织免受炎症侵害［21］。

综上所述，本研究在动物模型中证明了FMT 对LPS 诱导的ALI 的保护作用，并表明该过程可能与抗炎因子的增加相关。其机制可能是肠道微生物的代谢产物抑制TLR4/MyD88 途径，抑制NF-κB 磷酸化，促进细胞因子IL-10 的分泌增加，发挥其抗炎作用。