梁慧贤，闫鹤

（华南理工大学食品科学与工程学院，广东广州 510640）

肺炎克雷伯菌是一种引起人与动物感染条件致病菌[1]，在兽医临床上，肺炎克雷伯菌可以引起猪发病，已成为规模化猪场病原菌之一[2]，其对猪场造成的危害不容忽视。猪感染肺炎克雷伯菌会引发多种器官组织病变，导致极高的致病率和致死率[3]。国内外都有报道猪场发生猪感染肺炎克雷伯菌大爆发的事件，引起猪感染疾病进而死亡，给猪场造成巨大的经济损失[4-5]。现阶段，研究者主要探究猪源肺炎克雷伯菌的耐药性[2,6-7]，其毒力因子的携带情况以及毒力因子与进化之间的关系缺乏完整的研究。

肺炎克雷伯菌在感染宿主过程可通过毒力因子起到自身免疫防御的效果，从而使肺炎克雷伯菌成功入侵宿主细胞，进而存活、增殖[8]。根据肺炎克雷伯菌侵染过程，相关毒力因子分为五类：荚膜、脂多糖、菌毛（1 型菌毛以及3 型菌毛）、铁载体因子（肠杆菌素、耶尔森菌素、气杆菌素、沙门菌素）[8]以及细菌Ⅵ型分泌系统（T6SS)[9]。第一类毒力因子荚膜是包裹细胞的多糖基质，是肺炎克雷伯菌必需的毒力因子[10]。荚膜由位于染色体上的荚膜多糖基因簇（wzi、wza、wzb、wzc、gnd、wca、cpsB/manB、cpsG/manC和galF）合成[11]，荚膜合成的调控基因rcsA和rcsB可以增加荚膜的合成[8]。第二类毒力因子脂多糖（LPS）也称为内毒素，是所有革兰氏阴性菌细胞壁的主要和必要的成分[8]。第三类毒力因子菌毛是肺炎克雷伯菌粘附的重要介质，在肺炎克雷伯菌中，1 型和3 型菌毛是主要的具有致病性的粘附因子。1 型菌毛是细菌细胞表面上的细丝状突起[12]，由基因簇fimBEACDFGHK编码；3 型菌毛则是细菌细胞表面上的螺旋状细丝，由mrkABCD基因簇编码[13]，与生物膜形成有关[14]。第四类毒力因子铁载体因子，包括肠杆菌素、耶尔森菌素、气杆菌素和沙门菌素。肠杆菌素被认为是肺炎克雷伯菌主要的铁吸收系统[15]，生物合成与基因簇entABCDEF和编码介导其转运的蛋白质基因簇fepABCDG有关[16]。最后一类是VI 型分泌系统（T6SS），是一种属于多功能收缩注射系统（CIS）的多蛋白的装置[17]，作为一种新型的毒力因子，在重塑细菌群落中和直接或间接地在发病机理中起关键作用[18]。越来越多的研究表明，猪源肺炎克雷伯菌携带多种毒力因子，其毒力威胁不容忽视。Liu 等[19]发现中国四川省猪场分离的1 株猪源高毒力肺炎克雷伯菌SCsl1，携带含有耶尔森氏菌高致病岛的新型整合和结合元件。Chen 等[20]报道了从猪肺组织中分离的肺炎克雷伯菌ZYST1 中携带含有两个T6SS 基因簇的新的多重耐药和毒力元件。携带多种毒力因子的猪源肺炎克雷伯菌给兽医临床提出新的挑战。

全基因组序列正迅速成为预测肺炎克雷伯菌的毒力因子的有利工具，尤其是对于了解相关菌株基因特征和进化关系具有重要意义[21]。国内外已有研究者通过全基因组测序方法研究肺炎克雷伯菌的毒力因子携带情况[20,22]。基于7 个管家基因（rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB和tonB）的核苷酸序列的多位点序列分型（Mutilocus sequence typing，MLST）方法常用于肺炎克雷伯菌的进化分析[23]。

鉴于目前对猪源ST37 型肺炎克雷伯菌携带的毒力基因与进化之间的关系尚缺乏了解。因此本研究基于全基因组测序，对一株多重耐药猪源ST37 型肺炎克雷伯菌KP200 和不同来源的160 株ST37 型肺炎克雷伯菌进行比较毒力因子分析，并进一步通过菌株比较基因组分析分析，探究菌株毒力与遗传进化关系的相关性，为全面掌握肺炎克雷伯菌的毒力因子提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 菌株

肺炎克雷伯菌KP200 分离自广东省某养猪场的患腹泻的猪的肝脏。药敏试验结果显示，KP200 对头孢西汀、头孢他啶、头孢噻肟、头孢噻吩、苯唑西林、氨曲南、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、环丙沙星、恩诺沙星、氟苯尼考、氯霉素、四环素、米诺环素、复方新诺明以及红霉素表现出耐药，对多粘菌素B、美罗培南以及亚胺培南敏感。

1.2 相关试剂

Luria-Bertani 液体培养基，广州环凯微生物科技有限公司；Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）、dNTPs、缓冲液、琼脂糖，日本TaKaRa 公司；引物，生工生物工程（上海）股份有限公司合成；细菌基因组DNA 快速提取试剂盒，Marker DL2000，北京博迈德生物技术有限公司；核酸染料，上海捷瑞生物工程有限公司。

1.3 16S rRNA 基因PCR 扩增

通过细菌基因组DNA 快速提取试剂盒提取细菌DNA。使用16S rRNA 基因全长通用引物，引物序列为 27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’）扩增目标条带，预期条带大小为1500 bp。PCR 反应体系及条件为：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 90 s，30 个循环；72 ℃ 5 min。将PCR 扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳，于凝胶成像系统中观察结果。将符合预期模板大小的扩增产物委托上海美吉生物医药科技有限公司测序，然后将得到的16S rDNA 序列提交到（National Center for Biotechnology Information）NCBI 核酸数据库中进行BLAST 在线分析。

1.4 全基因组测序与注释

肺炎克雷伯菌KP200 通过Illumina MiSeq 和Pacbio RS II 测序仪进行全基因组测序。测序所得raw reads 序列使用SPAdes v3.9.0 和Canu v1.4 软件进行组装，并通过PGAP（Prokaryotic genome annotation pipeline）进行基因预测与功能注释。采用Glimmer 3.02软件进行开放阅读框（Open reading frame，ORF）预测，将所有预测蛋白序列与非冗余蛋白数据库NR、Swiss-Prot 数据库、eggNOG（Evolutionary genealogy of genes：Non-supervised Orthologous Groups）数据库进行BLASTp（E＜1e-10）比对，完成蛋白序列功能注释。

1.5 MLST 分析

根据PasteurMLST 数据库，确定7 个管家基因（rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB、tonB）的等位基因号，得出肺炎克雷伯菌KP200 菌株的ST 型别。

1.6 毒力因子分析

使用毒力因子Virulence Factors of Pathogenic Bacteria（VFDB）数据库，对肺炎克雷伯菌KP200 和NCBI GenBank 数据库中所有ST37 型肺炎克雷伯菌（160 株），进行毒力因子分析。

1.7 单拷贝基因组进化

通过prokka v1.14.6（默认参数）[24]获得肺炎克雷伯菌KP200 和160 株ST37 型肺炎克雷伯菌的注释基因文件和蛋白文件。统一使用orthofinder v2.4.0[25]（推荐参数）得到161 株菌株的单拷贝同源蛋白序列文件，接着使用muscle v3.8.31[26]（推荐参数）进行多蛋白序列比对，最后使用默认参数的MEGA X[27]构建单拷贝核心同源蛋白序列Maximum-likelihood（ML）进化树，Bootstrap 值设置为1000 次。

1.8 数据分析

肺炎克雷伯菌KP200 和160 株ST37 型肺炎克雷伯菌携带的毒力基因携带情况进行汇总统计，包括单个毒力基因的携带菌株数以及每株菌携带毒力因子的种类数。基于单拷贝基因组进化树聚类，将161 株ST37 型肺炎克雷伯菌存在差异的毒力基因以热图的形式展现。

2 结果与讨论

2.1 肺炎克雷伯菌KP200 基因组的基本特征

肺炎克雷伯菌KP200 的基因组全长为5257665 bp，平均GC 含量为58.78%，共有5106 个编码基因，基因组测序的圈图如图1 所示。根据PasteurMLST 数据库比对7 个管家基因（rpoB-1、gapA-2、mdh-2、pgi-1、phoE-13、infB-9和tonB-16），确定肺炎克雷伯菌KP200的分型为ST37。尽管ST37 型肺炎克雷伯菌不属于某一特定的克隆群，但ST37 型是耐广谱β-内酰胺临床肺炎克雷伯菌的重要型别[19,26]。

图1 肺炎克雷伯菌KP200 全基因组染色体圈图Fig.1 Circular map of Klebsiella pneumoniae KP200 chromosome

2.2 161 株肺炎克雷伯菌的毒力基因预测结果

研究表明，ST37 型是耐广谱β-内酰胺临床分离株中常见型别[19,28]，因此需要进一步全面掌握该型别携带的毒力因子。NCBI 目前已有的160 株ST37 型肺炎克雷伯菌，其中来自人源（109 株），未知来源（33株），鸡源（9 株），环境来源（8 株）以及食品（1 株）。目前为止，只有KP200 为猪源的ST37 型肺炎克雷伯菌。目前大多数研究主要集中于临床肺炎克雷伯菌的毒力情况进行分析[29-30]。尽管有研究对宠物医院的ST37 型肺炎克雷伯菌携带的耐药基因情况进行监测[31]，但是目前没有针对猪源ST37 型肺炎克雷伯菌的毒力因子携带情况进行分析的研究。161 株肺炎克雷伯菌经过毒力因子分析，共发现76 种毒力因子，其中19 种毒力因子为所有菌株共有的。161 株菌种都携带的21 种毒力基因分别为：1 型菌毛基因fimACFGI、3型菌毛基因mrkDCHJ、肠杆菌素entABCEF和fepABC、荚膜合成调节基因rcsAB。

针对差异的毒力基因分析表明（图2），荚膜相关基因在161 株菌中分布存在差异：133 株菌携带cpsACP基因，158 株菌携带galF基因，109 株菌携带gnd基因，118 株菌携带ugd基因，81 株菌携带manBC基因，然而包括KP200 在内的161 株ST37 型肺炎克雷伯菌中存在荚膜基因的缺失。研究表明，与无荚膜的肺炎克雷伯菌相比，有荚膜的肺炎克雷伯菌被先天免疫细胞吞噬的可能性更低[32]。LPS 相关基因在161株菌中分布同样存在差异，其中11 株菌携带glf、wbbM、wbbO、wzm、wzt基因，9 株菌携带kfoC基因，12 株菌携带wbbN基因，携带完整LPS 毒力因子的菌株共有9 株。结果表明，包括KP200 在内的大多数ST37 型肺炎克雷伯菌存在LPS 合成相关的基因缺失，可能导致毒力减弱[33]。

1 型菌毛编码基因簇fimBEACDFGHK在161 株菌中分布存在差异（图2），158 株菌携带1 型菌毛基因fimH；160 株菌携带1 型菌毛基因fimDE；157 株菌携带1 型菌毛基因fimB，只有KP200 和来自中国临床肺炎克雷伯菌5422 两株菌携带1 型菌毛基因fimK，该基因一般认为其功能涉及1 型纤维调节[34]，进一步分析得出携带完整的1 型菌毛基因fimA、fimB、fimC、fimD、fimE、fimF、fimG、fimH、fimI和fimK的菌株只有KP200 和5422。而研究表明，在90%的临床和环境肺炎克雷伯菌分离株中以及几乎所有的肠杆菌科菌株中表达1 型菌毛[12]。3 型菌毛携带情况：159 株菌携带3 型菌毛基因mrkA，158 株菌携带3 型菌毛基因mrkB，160 株菌携带3 型菌毛基因mrkFI，因此共有包括KP200 在内的158 株菌携带完整的编码3 型菌毛基因mrkABCD。在3 型菌毛中，大部分的结构由mrkA亚基和位于尖端的粘附素mrkD组成。基因mrkBCE参与组装和表达调控，而mrkF参与菌毛的表面稳定性[35]。据报道，检测3 型菌毛基因主要针对基因mrkD的检测[36-37]。

图2 161 株肺炎克雷伯菌毒力基因分布图Fig.2 Results of virulence factors detection for the 161 isolates of Klebsiella pneumoniae

铁载体因子分析结果表明（图2），161 株肺炎克雷伯菌基因组均携带entABCEF和fepABC肠杆菌素基因，仅entD、fepD、fepG、fes和ybdA在161 株肺炎克雷伯菌的分布存在差异，进一步分析得出肠杆菌素相关基因存在于所有的ST37 型肺炎克雷伯菌中，与Paczosa 等[8]的研究结果相符。针对沙门菌素分析，仅有KP200 和其他15 株肺炎克雷伯菌携带iroN沙门菌素基因。据报道，检测沙门菌素主要针对基因iroB[38]和iroN[39]的检测。KP200 不携带携带耶尔森杆菌素相关基因，26.09%（42/161）的菌株携带耶尔森杆菌素相关基因，Hsieh 等[16]研究发现仅18%的非高毒力肺炎克雷伯菌携带耶尔森杆菌素，说明ST37 型肺炎克雷伯菌的毒力值得关注。161 株肺炎克雷伯菌基因组中，仅有包括肺炎克雷伯菌KP200在内的16株携带气杆菌素转运基因iutA，常作为识别高毒力肺炎克雷伯菌的特征基因之一[38]。研究发现，仅有6%的非高毒力的临床肺炎克雷伯菌发现气杆菌素[40]，而本次研究中仅有2.48%（4/161）携带完整编码气杆菌素基因iucABCD-iutA。

本研究是首次探讨ST37型肺炎克雷伯菌T6SS的基因携带情况。对T6SS 相关基因分析表明（图2），KP200 携带完整的T6SS 基因，161 株肺炎克雷伯菌携带T6SS 基因存在差异：55 株菌携带tssJFG基因，158 株菌携带tssKBCDL基因，37 株菌携带tssI基因，157 株菌携带tssH基因，2 株菌携带tssM基因。该结果与Storey 等[9]对全球700 个基因组进行T6SS 基因对比分析结果相似：T6SS 基因在整个肺炎克雷伯菌中具有广泛的多样性。更有研究发现，猪源肺炎克雷伯菌除了携带两个T6SS 基因簇外还携带相关的信号通路调控蛋白同源物tfoX和qstR以及自然感受态蛋白comEA和comEC，有利于肺炎克雷伯菌的杀伤作用和吸收外来DNA 的作用[20]。

161 株肺炎克雷伯菌携带的毒力因子的种类统计的分析结果可以看出（图3），所有菌株都携带5 类以上毒力因子，其中仅有未知来源肺炎克雷伯菌AR_0139 携带9 类毒力因子，4 株人源菌株（肺炎克雷 伯 菌 AS012426、3189STDY5864948、3189STDY5864949 以及PB86）仅携带5 类毒力因子，携带6 类毒力因子的菌株数量最多为102 株。该结果比Kim 等[41]通过PCR 检测的分离自肝脓肿病人粪便的ST37 型肺炎克雷伯菌携带的毒力因子种类多。同样地，本研究结果比Shao 等[42]通过PCR 检测的分离自重症新生儿血液的ST37 型肺炎克雷伯菌携带的毒力因子种类多。本研究与其他研究者的研究结果存在差异可能是由于仅通过PCR 检测的毒力因子种类较少，不能全面地反映ST37 型肺炎克雷伯菌携带毒力因子种类，表明了本研究基于全基因组序列研究ST37型肺炎克雷伯菌携带毒力因子种类情况的重要意义。

图3 161 株ST37 型肺炎克雷伯菌毒力因子携带情况Fig.3 The virulence factors of 161 Klebsiella pneumoniae isolates

2.3 单拷贝基因组进化分析与毒力情况的关系

目前，基于全基因组进化方法分析菌株之间的进化关系已较为普遍，但对于肺炎克雷伯菌主要是研究临床爆发菌株之间的进化关系，尚未将ST37 型菌株的毒力情况与进化关系相结合进行研究。161 株ST37型肺炎克雷伯菌共检测到2563 个单拷贝基因，基于单拷贝基因构建系统进化树，进化树分析结果表明（图4），161 株ST37 型肺炎克雷伯菌主要位于四个不同的分支。该结果与Zhang 等[43]对分离自家禽生产环境中ST37 型肺炎克雷伯菌的进化结果相似。本研究将毒力基因型与单拷贝基因组进化关系相对应（图4）。结果显示，KP200 位于第四个分支，且与其他来自人源的5 株肺炎克雷伯菌形成一个簇，它们携带的毒力因子分布大致相同，亲缘关系较近。该结果与Yang 等[44]对分离自牛和人的肺炎克雷伯菌的进化分析结果相似：牛源肺炎克雷伯菌分离株与人源肺炎克雷伯菌分离株高度混合。除此之外，含气杆菌素毒力基因的3株来自中国的环境样本菌株（SC401、SC417 以及WX410）的亲缘关系相对于其他菌株更为接近。该结果与Marques 等[45]对18 个家庭的人和伴侣动物的粪便分离的肺炎克雷伯菌的进化分析结果相似：从同一环境的人和伴侣动物的粪便分离的肺炎克雷伯菌亲缘关系较近，且携带的毒力因子相似。

图4 161 株ST37 型肺炎克雷伯菌进化关系及毒力因子分布图Fig.4 Evolution relationship and virulence factors profiles of 161 Klebsiella pneumoniae isolates

3 结论

本研究对1 株多重耐药猪源ST37 型肺炎克雷伯菌KP200 和160 株ST37 型肺炎克雷伯菌进行毒力因子比较分析，以及探讨ST37 型肺炎克雷伯菌的毒力与遗传进化关系。毒力因子分析表明，肺炎克雷伯菌KP200 携带7 类毒力因子，毒力因子种类较多，具有潜在的致病性。进一步对161 株ST37 型肺炎克雷伯菌毒力基因型与进化关系之间的分析发现，所有菌株都携带多种类型的毒力因子，毒力因子分布具有差异性，且亲缘关系较近的菌株其毒力基因型较为相似。本研究在猪源肺炎克雷伯菌的毒力及进化研究中具有一定的意义。