范明娟 聂玉强 詹琪 李洁

广州市第一人民医院老年病科（广州 510180）

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是世界范围内最常见的慢性肝病，与血脂异常密切相关［1-2］。然而目前仍缺乏有效的NAFLD 防治策略。锌alpha2糖蛋白（ZAG）是一种新型脂肪细胞因子，参与脂质分解、脂肪酸氧化等过程［3］。ZAG 通过调节相关基因表达显著改善NAFLD 小鼠肝脏脂肪变及炎症反应［4］。利拉鲁肽是临床糖尿病合并肥胖患者治疗常用药［5］。利拉鲁肽通过抑制细胞凋亡对棕榈酸诱导的肝细胞HepG2 损伤具有保护作用［6］。本研究以棕榈酸诱导的人肝癌细胞（HepG2）建立肝脂毒性损伤模型，初步探讨利拉鲁肽联合ZAG 对棕榈酸诱导的HepG2 细胞凋亡、脂质代谢和炎症因子表达的影响，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 组织来源选择2017 年2 月至2018 年6 月于我院就诊的40 例NALFD 患者肝组织（穿刺活检标本）。其中男31 例，女9 例，平均年龄（45.7 ±8.3）岁。选择年龄、性别相匹配的无肝脏疾病的40 例志愿者肝组织作为正常对照。NALFD 患者符合《非酒精性脂肪性肝病诊疗指南（2010 年修订版）》诊断标准，且排除可导致脂肪肝的其他特定疾病和2 周内服用过利尿剂、皮质激素等影响糖代谢、脂代谢以及服用过保肝药物患者。本研究的开展获得我院伦理委员会批准，所有研究对象均知情同意。

1.2 实验材料人肝癌细胞系HepG2 购自中国科学院上海细胞库；利拉鲁肽（纯度99%）、棕榈酸（纯度99%）购自上海源叶生物科技公司；稳定敲减ZAG 的质粒（ZAG shRNA）及其对照（NC shRNA）、ZAG 过表达质粒（pcDNA-ZAG）及其对照（pcDNA）购自上海生工公司；总RNA 提取试剂盒购于北京普洛麦格生物；HiScript 逆转录酶试剂盒、SYBR qPCR Master Mix 试剂盒购于南京诺唯赞生物公司；甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）含量测定试剂盒、白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）酶联吸附测定（ELISA）试剂盒购于北京索莱宝生物公司；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（PI）细胞凋亡检测试剂盒购于上海贝博生物公司；显微分光光度计（型号K5500）购自北京凯奥科技公司；荧光定量PCR仪（7500 型）购于美国ABI 公司；流式细胞仪（Gallios 型）购于美国贝克曼公司；酶标仪（ELX800 型）购自美国Bio-Tek 公司。

1.3 细胞培养、转染和分组采用含10%胎牛血清的DMEM 培养基在含5% CO2、37 ℃的培养箱中复苏HepG2 细胞，当细胞90%汇合时加入胰蛋白酶消化，按照1∶3 比例转移至新的培养瓶培养。将对数期HepG2 细胞按照2×105个/孔密度铺6 孔板，利用脂质体Lipofectamine 2000 将ZAG shRNA、NC shRNA、pcDNA-ZAG、pcDNA 分别转染60%汇合的细胞，收获转染48 h 细胞按照实时定量PCR（RT-qPCR）和蛋白质印迹法分析转染效果，随后进行下一步实验。未处理的HepG2 细胞记为对照（Con）组；用含0.4 mmol/L 棕榈酸的培养液孵育细胞24 h［5］记为棕榈酸组；用含0.4 mmol/L 棕榈酸、100 nmol/L 利拉鲁肽培养液孵育细胞24 h［5］记为棕榈酸+利拉鲁肽组；用含0.4 mmol/L 棕榈酸的培养液孵育转染pcDNA-ZAG 细胞24 h 记为棕榈酸+pcDNA-ZAG 组；采用含0.4 mmol/L 棕榈酸、100 nmol/L 利拉鲁肽培养液分别孵育转染ZAG shRNA、pcDNA-ZAG 细胞24 h 记为棕榈酸+利拉鲁肽+ZAG shRNA 组、棕榈酸+利拉鲁肽+pcDNAZAG 组。

1.4 RT-qPCR 检测ZAG mRNA 表达总RNA 提取试剂盒从HepG2 细胞提取总RNA，并采用K5500显微分光光度计进行定量；利用HiScript 逆转录酶试剂盒将500 ng RNA 反转录为cDNA，根据SYBR qPCR Master Mix 试剂盒说明书进行RT-qPCR。利用β-actin 作为内部参照，2-ΔΔCt法确定ZAG mRNA表达量。β-actin 引物上游5′-TCCCTGGAGAAGAGCTACG-3′，下游5′-GTAGTTTCGTGGATGCCACA-3′；ZAG 引物上游5′-GCTTACCTGGAGGAGGAGTG-3′，下游5′-TTCCCTGGGTAGAAGTCGTAG-3′。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡将上述细胞收集于离心管中，PBS 洗涤2 次，重悬于500 μL 结合缓冲液中使细胞密度为2×105个/mL。用5 μL FITCAnnexin V、5 μL PI 在黑暗中染色15 min。1 h 内采用流式细胞仪检测细胞凋亡百分比。

1.6 细胞内TG、TC 含量测定参照TG、TC 测定试剂盒分析细胞内TG、TC 水平。

1.7 IL-6 和TNF-α 释放量检测采用ELISA 试剂盒测定细胞上清液中IL-6 和TNF-α 水平。将细胞上清液、标准品分贝添加至包被孔（预先涂有特异性抗体），37 ℃下孵育1.5 h，向每个孔中添加酶联抗体37 ℃下孵育1 h，向每个孔中添加生物素抗体37 ℃下孵育30 min；加入终止溶液结束显色反应。酶标仪测量样品在450 nm 处的吸光度，绘制标准曲线并计算IL-6 和TNF-α 释放量。

1.8 蛋白质印迹法分析ZAG、Bcl-2 和Bax 蛋白表达量RIPA 裂解缓冲液孵育细胞10 min，超声处理细胞三次破碎细胞，4 ℃下12 000 r/min 离心10 min 收集上清液。使用BCA 试剂盒确定蛋白浓度，取等量蛋白样品上样至十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。将蛋白条带转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜后，用5%脱脂牛奶缓冲液封闭膜1 h，然后将膜与特定的一抗在4 ℃下孵育过夜。再用对应的二抗孵育膜1 h。使用增强化学发光溶液进行显色反应。Image Lab 6.0 软件分析各条带的灰度值，以目的蛋白与内参β-actin 灰度值的比值表示目的蛋白表达量。

1.9 统计学方法使用SPSS 软件（20.0 版本）进行统计分析，实验结果均采用均值±标准差表示，两组比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析和SNK-q检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ZAG 在棕榈酸诱导的HepG2 细胞中的表达及NALFD 患者肝组织中的表达与对照组比较，棕榈酸组HepG2 细胞ZAG 在mRNA 和蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05），见图1A-C、表1。与正常肝组织比较，NALFD 患者肝组织ZAG mRNA和ZAG 蛋白的表达水平显著降低（P＜0.05），见图1D。

图1 ZAG 在棕榈酸诱导的HepG2 细胞中的表达及NALFD 患者肝组织中的表达Fig.1 Expression of ZAG in HepG2 cells induced by palmitic acid and in liver tissues of NALFD patients

表1 ZAG 在棕榈酸诱导的HepG2 细胞中的表达Tab.1 Expression of ZAG in HepG2 cells induced by palmitic acid

表1 ZAG 在棕榈酸诱导的HepG2 细胞中的表达Tab.1 Expression of ZAG in HepG2 cells induced by palmitic acid

注：与对照组相比，*P ＜0.05

2.2 利拉鲁肽对棕榈酸诱导的HepG2 细胞ZAG表达的影响与对照组比较，利拉鲁肽组HepG2细胞ZAG mRNA 和ZAG 蛋白表达量显著升高（P＜0.05）；与棕榈酸组比较，棕榈酸+利拉鲁肽组HepG2 细胞ZAG mRNA 和ZAG 蛋白表达量显著升高（P＜0.05）。见图2、表2。

表2 利拉鲁肽对棕榈酸诱导的HepG2 细胞ZAG 表达的影响Tab.2 Effect of liraglutide on ZAG expression in HepG2 cells induced by palmitic acid

表2 利拉鲁肽对棕榈酸诱导的HepG2 细胞ZAG 表达的影响Tab.2 Effect of liraglutide on ZAG expression in HepG2 cells induced by palmitic acid

注：与对照组相比，*P ＜0.05；与棕榈酸组相比，#P ＜0.05

图2 利拉鲁肽对棕榈酸诱导的HepG2 细胞ZAG 表达的影响Fig.2 Effect of liraglutide on ZAG expression in HepG2 cells induced by palmitic acid

2.3 ZAG shRNA、pcDNA-ZAG 转染效果检测与NC shRNA 组比 较，ZAG shRNA 组HepG2 细 胞ZAG 蛋白表达量显著降低（P＜0.05）；与pcDNA 组比较，pcDNA-ZAG 组HepG2 细胞ZAG 蛋白表达量显著升高（P＜0.05）。见图3、表3。

表3 Westernblot 检测ZAG shRNA 和pcDNA-ZAG 的转染效果Tab.3 The transfection effect of ZAG shRNA and pcDNA-ZAG was detected by Westernblot

表3 Westernblot 检测ZAG shRNA 和pcDNA-ZAG 的转染效果Tab.3 The transfection effect of ZAG shRNA and pcDNA-ZAG was detected by Westernblot

注：与NC shRNA 组相比，*P ＜0.05；与pcDNA 组相比：#P ＜0.05

图3 Western blot 检测ZAG shRNA 和pcDNA-ZAG 的转染效果Fig.3 Transfection effect of ZAG shRNA and pcDNA-ZAG detected by Western blot

2.4 利拉鲁肽通过ZAG调控棕榈酸诱导的HepG2细胞的凋亡、脂质代谢和炎症因子表达与对照组比较，棕榈酸组HepG2 细胞凋亡率、Bax 蛋白表达量、TG、TC、IL-6、TNF-α 含量显著升高，Bcl-2 蛋白表达量显著降低（P＜0.05）；与棕榈酸组比较，棕榈酸+利拉鲁肽组HepG2 细胞凋亡率、Bax 蛋白表达量、TG、TC、IL-6、TNF-α 含量显著降低，Bcl-2蛋白表达量显著升高（P＜0.05）；与棕榈酸+利拉鲁肽组比较，棕榈酸+利拉鲁肽+ZAG shRNA 组HepG2 细胞凋亡率、Bax 蛋白表达量、TG、TC、IL-6、TNF-α 含量显著升高，Bcl-2 蛋白表达量显著降低（P＜0.05）。见图4、表4。

图4 利拉鲁肽通过ZAG 调控棕榈酸诱导的HepG2 细胞的凋亡Fig.4 Liraglutide regulates palmitic acid-induced apoptosis in HepG2 cells via ZAG

表4 利拉鲁肽通过ZAG 调控棕榈酸诱导的HepG2 细胞的凋亡、脂质代谢和炎症因子表达Tab.4 Liraglutide regulates palmitic acid-induced apoptosis，lipid metabolism and inflamMolatory factor expression of HepG2 cells by ZAG

表4 利拉鲁肽通过ZAG 调控棕榈酸诱导的HepG2 细胞的凋亡、脂质代谢和炎症因子表达Tab.4 Liraglutide regulates palmitic acid-induced apoptosis，lipid metabolism and inflamMolatory factor expression of HepG2 cells by ZAG

注：与对照组相比，*P ＜0.05；与棕榈酸组相比，#P ＜0.05；与棕榈酸组+利拉鲁肽组相比，&P ＜0.05

2.5 利拉鲁肽联合ZAG对棕榈酸诱导的HepG2细胞凋亡、脂质代谢和炎症因子表达的影响与对照组比较，棕榈酸组HepG2 细胞凋亡率、Bax 蛋白表达量、TG、TC、IL-6、TNF-α 含量显著升高，Bcl-2蛋白表达量显著降低（P＜0.05）；与棕榈酸组比较，棕榈酸+利拉鲁肽组HepG2 细胞凋亡率、Bax 蛋白表达量、TG、TC、IL-6、TNF-α 含量显著降低，Bcl-2蛋白表达量显著升高（P＜0.05）；与棕榈酸组比较，棕榈酸+pcDNA-ZAG 组HepG2 细胞凋亡率、Bax 蛋白表达量、TG、TC、IL-6、TNF-α 含量显著降低，Bcl-2 蛋白表达量显著升高（P＜0.05）；与棕榈酸+利拉鲁肽组、棕榈酸+pcDNA-ZAG 组比较，棕榈酸+利拉鲁肽+pcDNA-ZAG 组HepG2 细胞凋亡率、Bax 蛋白表达量、TG、TC、IL-6、TNF-α 含量显著降低，Bcl-2 蛋白表达量显著升高（P＜0.05）。见图5、表5。

表5 利拉鲁肽联合ZAG 对棕榈酸诱导的HepG2 细胞凋亡、脂质代谢和炎症因子表达的影响Tab.5 Effects of liraglutide combined with ZAG on palmitic acid-induced apoptosis，lipid metabolism and expression of inflamMolatory factors in HepG2 cells

表5 利拉鲁肽联合ZAG 对棕榈酸诱导的HepG2 细胞凋亡、脂质代谢和炎症因子表达的影响Tab.5 Effects of liraglutide combined with ZAG on palmitic acid-induced apoptosis，lipid metabolism and expression of inflamMolatory factors in HepG2 cells

注：与对照组相比，*P ＜0.05；与棕榈酸组相比，#P ＜0.05；与棕榈酸组+利拉鲁肽组相比，&P ＜0.05；与棕榈酸+pcDNA-ZAG组相比，▽P ＜0.05

图5 利拉鲁肽联合ZAG 对棕榈酸诱导的HepG2 细胞凋亡的影响Fig.5 Effects of liraglutide combined with ZAG on palmitic acid-induced apoptosis in HepG2 cells

3 讨论

NAFLD 以其发病率、经济负担沉重而受到广泛关注［7］。研究表明，脂质沉积、氧化应激、脂质过氧化和炎症反应参与了NAFLD 进展［8-9］。利拉鲁肽干预可降低HepG2 细胞中脂肪酸合成酶水平，增加甘油三酯脂肪酶水平，改善HepG2 细胞脂代谢［10］。细胞中总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）水平是判断脂质沉积的重要指标［11］。本研究中棕榈酸处理显著提高HepG2 细胞中TC 和TG 水平，而利拉鲁肽干预显著逆转这一改变，说明利拉鲁肽可逆转棕榈酸诱导的HepG2 细胞脂质沉积。进一步研究发现，利拉鲁肽干预还可减弱棕榈酸诱导的HepG2 细胞凋亡。Bcl-2 和Bax 蛋白是参与细胞凋亡调控的重要因子［12］，Bax 移位至线粒体并促进其膜通透性改变进而导致凋亡诱导因子释放进而发挥促凋亡作用，而Bcl-2 则通过与Bax 结合抑制Bax 活性进而发挥抗凋亡作用［13］。本研究中利拉鲁肽干预显著下调棕榈酸诱导HepG2 细胞中Bax蛋白表达，上调Bcl-2 蛋白表达，与利拉鲁肽的抗凋亡作用吻合。IL-6、TNF-α 是最常用的炎性细胞因子［14-15］，研究指出TNF-α 和IL-6 表达增加与肝细胞脂肪酸摄取增加，脂质积聚以及肝细胞脂毒性相关［16］。本研究中利拉鲁肽干预显著降低棕榈酸诱导HepG2 细胞中TNF-α 和IL-6 水平，说明利拉鲁肽可减轻棕榈酸诱导HepG2 细胞炎症反应。

ZAG 是一种主要的组织相容性复合物Ⅰ分子和脂质动员因子，可促进脂质代谢和葡萄糖利用，并调节胰岛素敏感性。ZAG 除存在于脂肪组织外，其在骨骼肌、脑组织、肾脏以及肝脏亦存在广泛表达［17-18］。本研究发现NALFD 患者肝组织、棕榈酸诱导HepG2 细胞中ZAG 表达降低，而利拉鲁肽干预显著增加HepG2 细胞、棕榈酸诱导HepG2细胞中ZAG 表达量，提示利拉鲁肽对棕榈酸诱导的HepG2 细胞脂毒性损伤保护作用可能与调节ZAG 表达有关。本研究发现过表达ZAG 显著抑制棕榈酸诱导的HepG2 细胞凋亡，并降低TC、TG 水平，说明ZAG 可减轻棕榈酸诱导的HepG2 细胞凋亡、脂质积累和炎症反应。XIAO 等［19］研究证实ZAG 过表达可显著抑制脂肪生成、促进脂肪分解、脂肪酸氧化，进而减弱棕榈酸诱导的细胞内脂肪积累，与本研究发现基本吻合。NF-κB 是机体重要的炎症反应转录信号调节因子，其通过激活下游炎症因子IL-6 和TNF-α 转录，参与启动和扩大炎症反应，过表达ZAG 通过抑制NF-κB 途径显著抑制棕榈酸诱导的HepG2 细胞炎症反应［20-21］。本研究中过表达ZAG 显著降低棕榈酸诱导后HepG2细胞中IL-6 和TNF-α 水平，说明ZAG 可能通过调控NF-κB 途证发挥抗炎作用。进一步研究发现，沉默ZAG 表达显著减弱利拉鲁肽对棕榈酸诱导的HepG2 细胞凋亡、脂质沉积以及炎症反应的影响，过表达ZAG 则增强利拉鲁肽对棕榈酸诱导的HepG2 细胞凋亡、脂质积累和炎症反应的保护作用。

综上所述，利拉鲁肽可减轻棕榈酸诱导HepG2 细胞凋亡、脂质积累和炎症反应，其机制与利拉鲁肽上调ZAG 表达有关，本研究为利拉鲁肽防治非酒精性脂肪性肝病提供了理论依据。