张飞飞 张梦 王中山

1徐州医科大学麻醉学院，江苏省麻醉学重点实验室（江苏徐州 221004）；2徐州市中心医院，东南大学附属医院妇产科（江苏徐州 221009）

内皮素（endothelin，ET）主要包括三种同分异构体亚型，分别是ET-1、ET-2、ET-3，皮肤中主要表达ET-1［1］。内皮素通过特异性结合其受体（ETR）而发挥生物学效应，其受体分为两种亚型即内皮素A 受体（ETAR）和内皮素B 受体（ETBR），两者都是G 蛋白偶联受体。ET 和ETR 构成的内皮素轴在多种肿瘤包括黑色素瘤中有促进肿瘤的作用［2-4］。

黑色素瘤是一种恶性程度较高的皮肤肿瘤［5］，具有发病年龄早、转移率高、临床预后差等特点［6-7］，对各种化疗药物敏感性低且易产生耐药。随着恶性黑色素瘤的发病率在世界范围内呈上升的趋势［8］，迫切需要更有效的治疗方法。

研究表明［9-12］，与良性痣相比，ETBR 在黑色素瘤中的表达增加，ETBR 的激活与黑色素瘤的侵袭密切相关，对其进行阻断可达到一定的治疗效果［9，13］。另外β-arrestin1 作为支架蛋白通过ETR 信号转导在肿瘤发生、侵袭和转移等过程中发挥着重要的作用［14-16］。ET-1 激活ETR 后，吸引β-arrestin1到细胞膜聚集，而β-arrestin1 和ETR 之间的相互作用是通过ETR 的羧基末端识别介导的［17］。选择性干扰ETBR 和β-arrestin1 的相互作用，就可能阻止β-arrestin1 介导的信号通路。因此，研究和开发阻断ETBR 和β-arrestin1 相互作用的药物，很有可能具有良好的抗黑色素瘤作用。

在诸多抗肿瘤药物中，多肽类药物因其相对分子质量小、无免疫原性、结构简单、副作用小等优点越来越受到人们的重视，尤其是来源于人类自身蛋白的多肽。常规地采用化学合成法获得多肽不仅成本较贵，而且合成过程中可能引入一定的毒性，限制了临床应用范围。而大肠杆菌表达体系具有蛋白表达量高、易操作、培养成本低等优势，而且纯化的重组蛋白可以大规模生产，为进一步研究目的蛋白的生物活性奠定了良好的基础。

基于此，本研究拟在体外通过大肠杆菌表达体系表达纯化获得ETAR 羧基末端58 个氨基酸的多肽（ETAR-C58）。在黑色素瘤细胞中，该多肽很有可能和ETBR 竞争性地结合β-arrestin1，从而干扰了ET-1/ETBR/β-arrestin1 信号通路的传导，进而抑制了黑色素瘤的发展。实验结果表明，该多肽缓解了β-arrestin1介导的癌细胞迁移，侵袭等功能，为进一步开展对恶性黑色素瘤的科学研究和临床应用奠定了良好的基础。

1 材料与方法

1.1 材料人源性恶性黑色素瘤A375 细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库；大肠杆菌克隆宿主菌DH5α、表达宿主菌BL21（DE3）和表达质粒pWaldo-GFPe 均为本实验室保存；限制性内切酶、T4 DNA 连接酶购自NEB；Trizol、逆转录酶、DNA 聚合酶购自南京诺唯赞；ET-1 购自北京博奥森；DMEM 培养基购自南京凯基；胎牛血清FBS 购自Lonsera；胰蛋白酶（0.25% Trypsin-EDTA）购自Gibco；MatriGel 购自BD；8 微米孔径Transwell 24 孔板购自CELLTER；镍柱和分子筛购自GE 公司；GFP 标签抗体和HRP 标记的羊抗鼠二抗均购自ABclonal；PCR 引物合成及测序由上海生工完成；FX101 细胞破碎仪（上海励途公司）；蛋白纯化系统AKTA Pure（GE 公司）；全能型成像系统（UVItech）；研究级倒置显微镜（OLYMPUS 公司）；Nanodrop 2000、酶标仪、细胞培养箱（Thermo 公司）。

1.2 方法

1.2.1 ETAR-C58多肽基因的克隆提取人结肠癌HT-29 细胞的总RNA，根据逆转录酶的使用说明进行逆转录反应，以获得的cDNA 为模板，ETARC58F1：5′-CCATCTCGAGATGTACGGTCGTAAAAAACGTCGTCAGCGTCGTCGTTATTTTGTGAGCAAGAAATTTAAAA-3′（下划线处为XhoI 酶切位点，加粗部分为TAT 穿膜肽序列）和ETAR-C58R1：5′-CGTCGGATCCGTTCATGCTGTCCTTATGGCT-3′（下划线处为BamHI 酶切位点）为引物进行PCR 扩增，纯化后的PCR 产物经XhoI 和BamHI 酶切后克隆至pWaldo-GFPe 的相同位点，经酶切和测序验证后，获得重组质粒pWaldo-ETAR-C58。

1.2.2 ETAR-C58多肽的诱导表达与纯化将转化有重组质粒的BL21（DE3）表达菌株接种于200 mL含30 μg/mL 卡纳青霉素的LB 培养基中，37 ℃过夜培养，然后转接50 mL 菌液至1 000 mL LB 培养基中，37 ℃培养至OD600约为0.6，加入0.2 mmol/L 的IPTG，20 ℃诱导表达20 h 后，6 000 g 离心15 min收集菌体，并用80 mL 裂解缓冲液悬浮（20 mmol/L Tris-HCl pH8.0，300 mmol/L NaCl），加入50 μg/mL溶菌酶、200 U DNAase I 和1 mmol/L PMSF 后，采用细胞破碎仪800 MPa 破碎细胞两次，4 ℃、8 000 r/min离心30 min去除细胞碎片。取上清液自然流过镍柱，用100 mL 洗涤缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl pH8.0，300 mmol/L NaCl，10%甘油和30 mmol/L咪唑）冲洗柱子，用含高浓度咪唑的洗脱缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl pH 7.5，300 mmol/L NaCl，10%甘油和300 mmol/L咪唑）洗脱目的蛋白质，收集蛋白质样品，过分子筛柱子（缓冲液含20 mmol/L Tris-HCl pH 7.5，300 mmol/L NaCl，10%甘油），收集有吸收峰的蛋白质样品，SDSPAGE 检测样品的纯度，采用Nanodrop 2 000 测定多肽浓度。

1.2.3 免疫印迹鉴定诱导表达的融合蛋白通过SDS-PAGE 分离后，通过湿转的方法转移到PVDF膜上，随后将膜用含有5%脱脂奶粉的TBST 室温孵育2 h，加GFP 标签抗体（1∶1 000）于4 ℃孵育过夜，随后TBST 洗膜3 × 3 min，加入HRP 标记的羊抗鼠二抗（1∶2 000）室温孵育1 h，TBST 再次洗膜6 × 3 min，加入ECL 发光液，用UVI-tech 的全能型成像系统进行拍照。

1.2.4 A375 细胞处理及分组干预将对数生长期细胞接种于3.5 cm 培养皿中，在10%FBS+高糖DMEM、37 ℃、5%CO2条件下培养，待细胞生长至融合率接近80%～90%时，进行无血清化处理12 h，胰蛋白酶消化后，用血球板计数（为保障数据的准确性，重复计数3 次并取其平均值），按如下分组加入等数量的细胞：对照组，ET-1 组（10 nmol/L），ET-1 组+ETAR-C58 多肽（2 μmol/L）组，其中ETARC58 多肽在ET-1 干预前1 h 加入，继续培养24 h，然后进行相应指标的检测。

1.2.5 TAT-ETAR-C58 融合多肽穿膜进入细胞的效率当接种于3.5 cm 培养皿的A375 细胞融合率接近80%～90%时，加入2 μmol/L 纯化的多肽，并于细胞培养箱中孵育6 h，PBS 洗涤后更换新鲜的完全培养基，过夜培养，通过荧光显微镜观察TATETAR-C58 融合多肽穿过细胞膜进入细胞的效率。

1.2.6 A375 细胞的迁移根据1.2.4 所述进行细胞的处理后，向24 孔板Transwell 上室加入用无血清DMEM 悬浮的细胞悬浮液2 × 104个细胞，用DMEM 补充至200 μL，下室加600 μL 含10%FBS的培养基。24 h 后移除上、下室的液体，下室加入600 μL 4%多聚甲醛室温固定细胞20 min。移除多聚甲醛，PBS 洗涤后，下室加入600 μL 0.5%结晶紫（PBS 配制）染色15 min。再用PBS 洗涤3 次，用棉棒将上室内壁和外壁残留的结晶紫擦除，切勿碰到膜的表面。将洗涤好的上室转移到新的24孔里，在显微镜下观察细胞并拍照。最后用20%乙酸进行洗脱，酶标仪OD600检测。

1.2.7 A375 细胞的侵袭用无血清的冷DMEM 按照1∶7 稀释Matrigel，取50 μL Matrigel 稀释液加到24 孔板Transwell 上室中，37 ℃培养箱里风干0.5 h。根据1.2.4 所述进行细胞的处理后，向24 孔板Transwell 上室加入用无血清DMEM 悬浮的细胞悬浮液5×104个细胞，用DMEM 补充至200 μL，下室加600 μL 含10%FBS 的培养基，接下来的步骤和迁移实验相同。

1.2.8 统计学方法数据以（）形式表示，采用Graphpad Prism 软件进行分析处理，两组间比较采用t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ETAR-C58 多肽基因的克隆按照1.2.1 所述的克隆步骤，通过限制性内切酶XhoI 和BamHI 鉴定获得重组子pWaldo-ETAR-C58，并送往上海生工公司测序。峰图整齐有序，ETAR-C58 多肽序列正确，共174 bp，编码形成6.8 kDa 的多肽，和TAT 穿膜肽（1.6 kDa）、GFP 标签（26 kDa）、TEV 酶切位点（0.9 kDa）融合后其相对分子质量约为35.3 kDa。见图1。

图1 ETAR-C58 多肽表达载体测序峰图Fig.1 Sequencing of ETAR-C58 peptide expression vector

2.2 ETAR-C58 多肽的诱导表达、纯化与鉴定将pWaldo-ETAR-C58 转化到E.coli BL21（DE3），经IPTG 诱导表达和SDS-PAGE 分析，融合蛋白得到很好的表达，大小与预期完全一致，且可溶性融合多肽的表达量约为总蛋白的90%。融合多肽经镍柱和分子筛纯化后，SDS-PAGE 检测纯度较高（＞95%），见图2A。免疫印迹结果表明，融合多肽可与GFP 抗体发生特异性结合，在相应位置有明显的条带，说明纯化获得的融合蛋白就是需要的目的多肽，见图2B。

图2 融合多肽TAT-ETAR-C58 的表达纯化及免疫印迹分析Fig.2 Expression，purification and western blotting analysis of fusion peptide

2.3 TAT-ETAR-C58融合多肽穿膜进入细胞的效率TAT 穿膜肽可以作为载体携带多肽或蛋白质片段，以非受体依赖的方式穿过细胞膜进入细胞。为了检测TAT-ETAR-C58融合蛋白穿膜进入细胞的效率，2 μmol/L 多肽和A375 细胞孵育6 h，显微镜整个视野下几乎所有的细胞均呈绿色，即TAT穿膜肽介导的融合蛋白进入细胞的效率较高。见图3。

图3 显微镜观察TAT-ETAR-C58 融合多肽的穿膜效率Fig.3 Transmembrane efficiency of fusion peptide identified by microscope

2.4 ETAR-C58 多肽对A375 细胞迁移和侵袭的影响根据1.2.4 所述的方法将处理的A375 细胞分为三组：对照组（Control）、ET-1 组、ET-1+ETARC58 多肽组，ET-1 组中添加10 nmol/LET-1，可以激活黑色素瘤细胞里ET-1/ETBR 组成的内皮素信号轴，ET-1+ETAR-C58 多肽组中提前添加2 μmol/L多肽，以期多肽干扰ET-1/ETBR/β-arrestin1 组成的信号通路，从而阻断ET-1 所引起的细胞效应。然后按照1.2.6 和1.2.7 所述的方法进行Transwell 迁移和侵袭实验，结果表明ET-1 组较对照组，转移和侵袭的细胞数明显增加，这与已报道文献的结果一致［18］；ET-1+ETAR-C58 多肽组可以部分阻断ET-1 组引起的细胞迁移和侵袭效应，即ETAR-C58多肽可以降低A375 细胞的迁移和侵袭能力，组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见图4。

图4 ET-1 和ETAR-C58 多肽对A375 细胞迁移与侵袭能力的影响Fig.4 The effects of ET-1 and ETAR-C58 peptide on migration and invasion of A375 cells by Transwell

3 讨论

TAT 穿膜肽是人类免疫缺陷病毒1（HIV-1）来源的参与病毒复制的反式转录激活蛋白，作为经典的细胞穿膜肽被广泛用于各种物质的胞内转运［19-21］。本研究结果表明大多数细胞都具有绿色荧光，即大多数TAT-ETAR-C58-GFP 融合蛋白可以进入细胞内发挥生物学功能，说明TAT 穿膜肽作为一种药物运输载体具有较大的潜力。

为了提高目的融合肽的表达量和克服小肽易被蛋白酶所降解的缺点，本研究选择以绿色荧光蛋白（GFP）作为融合标签，另外GFP 作为一种可以发出很强荧光的蛋白分子，可以很好地定位和追踪目的蛋白。为了防止GFP 标签影响多肽的活性，本研究在多肽和GFP 之间添加了TEV 蛋白酶的酶切位点，方便下一步获得没有标签的多肽。β-arrestin1 可作为GPCRs 信号的转换器，参与多种信号传导途径，引起细胞增殖、凋亡、组织的炎症反应及血管新生等生物学效应［22-23］。上述生物学效应与多种肿瘤的增殖、迁移、恶化、转移密切相关。β-arrestin1 作为癌症发生、发展的关键分子，靶向β-arrestin1 的药物研究将蕴含巨大的临床治疗潜力。有研究表明［18］，ET-1/ETBR/β-arrestin1 信号轴参与调节了黑色素瘤细胞的迁移和血管生成拟态。ZHANG 等［24］发现在黑色素瘤中主要表达截短的ETAR（缺少了外显子3 和4），而且该ETAR对ET-1 的亲和力较低。所以在黑色素瘤细胞中，主要是ET-1 和ETBR 组成的内皮素轴发挥作用，而且β-arrestin1 可以和ETR 羧基末端结合进而介导了信号通路的传导［17］，根据这些特点，本研究创新性设计的ETAR-C58 多肽，可能通过干扰ETBR和β-arrestin1 之间的相互作用，进而影响了该信号通路的传导，而实验结果表明，ETAR-C58 多肽抑制了A375 细胞的侵袭和转移。说明ETAR-C58 多肽可以干扰β-arrestin1 和ETBR 两者的相互作用，进而抑制肿瘤的发展。

本研究目前只是在体外水平，初步验证了ETAR-C58 多肽具有抗肿瘤的作用，下一步将采用TEV 酶切掉GFP 标签后，获得分子量更小的活性ETAR-C58 小肽，通过进行小鼠体内实验，进一步验证其抗肿瘤活性，并对其作用机制做进一步研究，以期开发出一种新型、高效、低毒，具有良好临床应用前景的治疗黑色素瘤的药物。