曾毓璐，唐国华

颅颌面创伤或发育畸形严重损害患者的身心健康，基于干细胞的再生治疗技术为其临床治疗带来了新的希望。但无论是外源性的组织工程技术或驱动内源性干细胞的活化，都要求明确干细胞类型及相关分子生物学机制。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是指在体外具有克隆性，能贴壁生长；强表达CD90、CD73、CD105、CD44；造血系标志物阴性；具备三系分化能力(成骨、成软骨、成脂)的一群细胞[1]。但体外条件存在改变细胞特性的可能，不同组织来源的MSCs在体内表现出了极大的异质性。因此Bianco等[2]在2015年明确了骨骼干细胞的概念，强调其在体内能分化为非造血系的骨组织相关细胞(包括骨、软骨、脂肪和基质细胞)，并具有自我更新能力。因其强调了体内成骨特性，在描述骨组织来源的多能干细胞时比MSCs更为准确，但目前尚缺乏明确一致的骨骼干细胞(skeletal stem cells，SSCs)标志物[3]。长骨中的Prx1+、Gremlin1+、PTHrP+细胞，颅面骨中的Gli1+、Prx1+、Axin2+细胞分别被证实具有SSCs的特征[4-5]。目前颅颌骨SSCs的研究刚刚起步，而对长骨SSCs的研究则相对较多[6]。长骨和颅面骨的Prx1+细胞表现出相似的特征，且长骨中Prx1+细胞也参与介导膜内成骨，因此Prx1+在长骨中的表现可以在一定程度上为颅面部SSCs的研究提供思路。本文回顾了Prx1基因在骨发育、改建、再生中的作用，以及Prx1+SSCs的研究进展，希望能为颅面部SSCs的深入研究提供参考。

1 Prx1基因

Prx1是编码转录因子的同源盒基因，在胚胎肢芽形成和颅面发育阶段高表达，其缺失会造成严重的发育畸形。以往的研究表明Prx1与间充质细胞未分化状态的维持相关，并通过间质凝集而参与骨的发育。

1.1 Prx1基因与胚胎发育

脊椎动物的骨组织起源于成骨前的间质凝集，Prx1可能在间质凝集早期介导上皮-间质转化而参与骨的形成[7]。Prx1功能失活的突变体在颅骨、肢芽、脊柱中出现了骨性缺损[8]。并且，Prx1协同与其功能相似的Prx2基因一起维持颅面部间充质细胞的未分化状态，Prx1-/-Prx2-/-的小鼠表现出了严重的畸形，包括外耳、中耳和内耳的缺损，颅骨质量减轻，腭裂，下颌骨缺损，下中切牙缺失，磨牙形态异常，并在出生后24 h内死去[9-11]。与小鼠类似，人Prx1基因的突变会造成无下颌合并耳畸形[12]。

1.2 Prx1基因参与维持干细胞特征

Prx1只在未分化的间充质细胞中表达，并随着分化而逐渐停止表达，提示Prx1具有抑制间充质细胞分化的作用[9]。非编码RNAgga-mir-133a-3p可通过抑制Prx1的表达来促进成肌细胞的分化[13]。Prx1的敲除可通过抑制转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)通路促进MSCs成脂，提示Prx1可能抑制MSCs的成脂分化[14]。在肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)作用下，Prx1表达增加，且Prx1的过表达能下调MSCs中的成骨分化相关基因Osx和RUNX2，提示Prx1是TNF-α抑制MSCs成骨分化的中间媒介[15]。此外，Prx1使少突胶质祖细胞的基因表达呈现静止期特征[16]，还参与维持了神经干细胞的自我更新能力[17]。Prx1对分化的抑制和对干细胞特征的维持使其具备了成为干细胞标志物的条件。

1.3 Prx1-Cre转基因小鼠模型

Cre-loxP系统是一种基因编辑技术，Cre重组酶可靶向切除loxP位点锚定的序列。Logan等[18]利用Prx1基因的增强子构建了Prx1-Cre小鼠，在Prx1调控元件的作用下，细胞条件性地表达Cre重组酶。当Prx1-Cre小鼠与带有loxP锚定目标基因的小鼠杂交时，其后代的Prx1+细胞发生由Cre介导的基因重组，可表达标记基因(如荧光蛋白或β-半乳糖苷酶)从而对Prx1+细胞进行谱系示踪，也可以特异性地删除某些基因构建条件敲除模型[19-20]，因此被广泛用于骨发育相关的研究。Cre酶与雌激素受体(estrogen receptor，ER)融合后，在他莫昔芬(tamoxifen)诱导下表达，使重组具有了时间上的可控性，Prx1-CreER小鼠可用于观察出生后Prx1+细胞在成体小鼠中发挥的作用。比如，将Prx1-CreER小鼠与条件表达白喉毒素的小鼠Rosa26LoxP-STOP-loxP-DTA杂交，可得到Prx1谱系删失的小鼠，从而观察成体中Prx1谱系删失对个体的影响。Prx1-Cre工具鼠的构建极大地推动了Prx1+细胞的分离、鉴定，并允许研究人员观察其在组织的分布情况、追踪其体内去向、观察其对个体发育或稳态维持的影响，是研究Prx1+细胞最常用的手段之一。

2 长骨中Prx1+ SSCs

长骨中的Prx1+细胞在体外高表达MSCs的标志物，在体内能发生扩增并分化为成骨细胞或软骨细胞，表现出SSCs样特征。近期Prx1+SSCs作为机械应力响应细胞受到关注。

2.1 分布和鉴定

Greenbaum等[21]和Ducharmp等[22]使用Prx1-Cre衍生小鼠，持续标记包括胚胎期在内的Prx1+细胞，分别鉴定了骨髓和骨膜中的Prx1+细胞，二者均表现出MSCs的部分特征。骨髓中的Prx1+细胞群能对造血干细胞起到支持作用，部分与PDGFRα+Sca1+细胞群交叠，具有成纤维细胞克隆形成单位(colony-forming unit-fibroblast，CFU-F)活性，在体外具有成骨和成脂分化能力，但基因图谱分析表明它们并不表达Nestin、CD146、LepR等MSCs的标志物[21, 23]。骨膜Prx1+细胞在体外具有三系分化能力，共表达PDGFRα、Gremlin 1、Cxcl12、Nestin等MSCs标志物，但不表达LepR[22]。与以上报道不同，Kawanami等[24]和Ouyang等[25]使用Prx1-CreER衍生小鼠，仅标记了成体小鼠中的Prx1+细胞，发现Prx1+主要分布于靠近皮质骨的骨膜中，其在体外诱导培养下具有成骨和成软骨分化潜能。这与Moore等[26]的实验结果一致，即成体小鼠的Prx1+定位于骨膜生发层和软骨膜，未见于皮质骨、小梁骨、骨髓和肌肉中。这些报道提示，Prx1+SSCs在胚胎期分布在骨髓和骨膜中，而出生后Prx1+细胞较为局限，仅表达于骨膜中。

2.2 Prx1+细胞参与长骨创伤修复

在长骨骨折的愈合过程中，凝血块逐渐机化并形成骨痂连接断端。Ducharmp de Lageneste等[22]和Murao等[27]发现骨痂中的细胞几乎全部来自于局部招募的骨膜Prx1+细胞，并排除了参与骨折修复的Prx1+细胞为循环来源的可能性。Wang等[28]则发现在骨折后10 d，Prx1+的后代骨细胞嵌入了断端靠近骨膜的皮质骨内，Prx1+细胞及其子代细胞也分布于连接断端的软骨内，但并未出现在骨内膜及骨髓侧，作者因此得出了Prx1+细胞通过骨表面的膜内成骨和骨痂中的软骨内成骨参与骨折修复的结论。这些实验提示，骨膜Prx1+SSCs可能通过被招募到创伤位点，为创伤修复提供成骨或成软骨细胞的方式参与长骨创伤的修复。

2.3 骨膜Prx1+应答机械应力

骨膜Prx1+SSCs是应力敏感细胞，能在应力作用下发生增殖、分化。近期的研究提示，纤毛介导了骨膜Prx1+SSCs对应力的应答作用，且骨增龄性变化与Prx1+SSCs密切相关。

首先，Prx1+细胞删失的小鼠个体在未受力和受到轴向压力的条件下均表现出了矿化沉积率的下降和骨形成速度的减缓，提示Prx1+细胞不但在静息状态参与骨的维持，也介导了机械诱导成骨反应[26]。在轴向压力的作用下，骨膜中Prx1+细胞的总数和处于增殖状态(Ki67+)的Prx1+细胞数均增加[29]，代表了Prx1+在应力作用下出现的增殖反应。在长骨缺损模型中，与有创伤未加力的对照组相比，压力在术后2～5 d和5～8 d分别使处于增殖状态的Prx1+Sca1+SSCs数目增加了116%和114%[30]，则进一步说明了Prx1+细胞能在创伤条件下响应应力增殖，有利于缺损修复。体外培养的Prx1+细胞在振荡流体流动中1 h后即表现出COX-2和OPN的mRNA上调[26]，代表了Prx1+细胞群在应力下快速产生了细胞反应，并表现出成骨分化趋势[26]。轴向压力施加数日后，Prx1+子代骨细胞出现在了皮质骨中，为Prx1+响应应力成骨提供了体内证据[31]。

初级纤毛是能将外界刺激转化为细胞内信号级联的感觉细胞器，在深入探讨Prx1+响应应力的具体机制时，研究人员发现初级纤毛的作用至关重要。首先，初级纤毛在Prx1+细胞内的条件敲除显著减少了轴向压力诱导成骨的量[31]，表明初级纤毛对Prx1+响应机械力成骨的过程是必须的。在初级纤毛完整时，流体剪切力可使Prx1+SSCs的OPN，RUNX2表达上调，条件敲除Prx1+SSCs中的纤毛后则不再有这种改变，提示初级纤毛可能参与了Prx1+细胞感知流体剪切力的过程[26]。此外，纤毛还介导了Prx1+细胞对旁分泌信号的响应，受到机械刺激的骨细胞的条件培养基用于培养Prx1+细胞时，能够促进Prx1+的成骨分化，但当Prx1+细胞的纤毛被敲除时，这种效应便消失了[26]。

Prx1+细胞的增龄性变化可能是老年个体骨质疏松的机制之一。首先，在老年小鼠的骨膜中，应力响应的Prx1+细胞数量在静息状态下少于成年小鼠。在轴向压力作用下，老年鼠增殖的Prx1+细胞数量较少，增殖状态维持的时间也短于成年小鼠，代表其机械响应能力的下降[29]。Prx1+在应力下的分化状态是否会随年龄改变有待研究。

3 颅面Prx1+ SSCs

近期的研究同样证实了Prx1+SSCs在颅面部中的存在，颅缝和牙周膜中的Prx1+细胞参与了组织缺损的修复。

3.1 颅缝SSCs的鉴定、分布、功能

Wilk等[32]检测了8～32周小鼠中Prx1+细胞的分布，发现颅面骨中的Prx1+细胞主要存在于颅缝中，但是限于后额缝、冠状缝、矢状缝和人字缝，并且随年龄的增加而不断减少，其他颅面缝、骨膜、硬脑膜和骨髓中均无表达。颅骨中分离出的Prx1+细胞可以体外形成克隆单位，在基因分析上表现出两个特点：首先是MSCs样的特征：包括高表达Pdgfrα和Mcam/Cd146；其次是典型静止期细胞的特征：低表达与细胞周期、染色体分裂和DNA复制相关的基因如Ccne2、Mcm4、Pcna；高表达与干细胞归巢相关的Itga2、Itga3、Itga6；高表达Wnt通路抑制基因Dkk1和Sost，有助于其维持未分化状态[32]。

细胞谱系追踪实验显示Prx1+细胞在生理情况下参与形成颅缝周围的骨膜和骨组织。在颅骨受到创伤时，可以直接观察到带有标记的Prx1+细胞进入创伤区，衍生为成骨细胞和骨细胞，并嵌入到新生骨中，Prx1+谱系删失和颅缝切除均会引起愈合障碍，表明Prx1+SSCs参与颅骨缺损的修复[32]。

Chang等[33]通过Prx1-Wnt-GFP报道小鼠观察了骨损伤模型中Prx1+细胞内的经典Wnt信号活动，结果显示Prx1+细胞参与由Wnt通路介导的膜内骨修复。 Yeh等[34]使用转基因鼠模型对Prx1+细胞展开谱系追踪，并用不同颜色荧光标记了Prx1+细胞及其子代细胞，发现使用经典Wnt通路激动剂Wnt3a处理后的颅缝在体积并未增加情况下，颅缝两侧均有新生骨的沉积，Prx1+细胞数量未明显增多，但其子代骨细胞明显增多， 并嵌入到新生骨中，提示经典Wnt可能促进了Prx1+细胞的分化。

3.2 牙周组织中的Prx1+细胞

Bassir等[35]近期确认了Prx1+细胞存在于小鼠切牙和磨牙的牙周膜韧带中，并且切牙中的表达明显高于磨牙，鉴于小鼠的切牙是终生不断萌出的，Prx1+细胞很可能参与了牙周膜的持续改建和再生。使用DTA对小鼠Prx1+细胞进行谱系删失会导致发育中的小鼠牙周膜间隙的明显增大，提示Prx1+参与了牙周组织的发育和维持，Prx1+谱系删失的小鼠同样表现出牙槽骨缺损修复障碍，表明Prx1+细胞参与了牙周组织修复再生的过程。

牙周组织来源的Prx1+细胞在体外基因分析上与颅缝Prx1+SSCs十分相似，并且Prx1基因在人类牙周膜干细胞中高表达[35]。因此探明Prx1+细胞在牙周组织再生中的作用，有助于激活内源性牙周膜干细胞的再生潜能，不仅有望为牙周治疗重建牙周组织提供希望，也有望加快正畸牙槽骨改建，提高正畸治疗的效率和成功率。

4 展 望

Prx1+细胞具有自我更新能力，可以为骨组织的发育、改建、创伤再生提供成骨和成软骨细胞，有望用于干细胞治疗去解决骨缺损或骨代谢类的问题。此外，Prx1+细胞与应力的关系非常值得关注。力是调控颅面部骨改建的重要控制因素，Prx1+细胞主要分布在骨膜、牙周膜、颅缝等应力丰富的区域，因此Prx1+细胞很可能是机械力调控骨改建的细胞靶点之一。目前颅面部SSCs与应力相关的研究相对缺乏，明确机械力对骨缝或牙周膜中Prx1+细胞的作用，有望为临床调控颅面骨生长、促进牙槽骨再生提供新的治疗策略。