向春燕 ，况 刚 ，盘思颖 ，李月平 △

（1. 重庆市黔江食品药品检验所，重庆 409003； 2. 重庆第二师范学院，重庆 400067）

小儿健脾丸具有健脾功效，临床广泛用于治疗脾胃虚弱引起的消化不良、体弱虚力等，全方由白术、茯苓、甘草、六神曲、南山楂、陈皮等15 味中药材组方，方中白术、茯苓、南山楂均有健脾功效，莲子清热燥湿，陈皮理气健脾，六神曲健脾和胃、消食调中，甘草补脾益气、调和诸药［1－2］。现行质量标准为《中华人民共和国卫生部药品标准·中药成方制剂（第二十册）》（WS3－B－3755－98），但仅收载药品性状项，茯苓、山药、甘草、南山楂、砂仁的显微鉴别项，丸剂的一般检查项，无含量测定项，质量标准的整体控制水平不全面。本研究中采用薄层色谱（TLC）法对小儿健脾丸中的陈皮进行定性鉴别，并建立了测定方中甘草酸含量的高效液相色谱（HPLC）法，以进一步提高该药的质量控制水平。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Linomat 5 型薄层点样成像仪（瑞士Camag 公司），配有CAMAG－Scanner3 型薄层扫描仪；HH－6 型电热恒温水浴锅（常州荣华仪器制造有限公司）；JP－500C型高速多功能粉碎机（永康市久品工贸有限公司）；GZX－9076MBE 型电热鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；MSA225S 型电子天平（德国赛多利斯科学仪器有限公司，精度为十万分之一）；XPE204 型电子天平（梅特勒－托利多集团公司，精度为万分之一）；Milli Direct － Q16 型（超）纯水机（美国密理博公司）；Agilent 1260 型高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司），配有在线脱气机、四元梯度泵、自动进样器、G4212B 型二极管阵列（DAD）检测器、色谱工作站；SB－800DT 型超声波提取器（宁波新芝生物科技股份有限公司，功率为800 W，频率为40 kHz）；硅胶G 薄层板（青岛海洋化工有限公司，批号为20180225）。

1.2 试药

小儿健脾丸（T 公司，批号分别为 19010721，19010722，19010723）；橙皮苷对照品（批号为 110721 －201617，含量为 96.1% ），甘草酸铵对照品（批号为 110731 －201619，含量为93.0%），均购自中国食品药品检定研究院；人参（宜宾仁和中药饮片有限责任公司，批号为190801）；白术（四川皓博药业有限公司，批号为201202）；茯苓（成都仁济宏药业有限公司，批号为200201）；甘草（重庆三立堂中药制药有限公司，批号为210601）；陈皮（四川云亳堂药业有限公司，批号为180301）；法半夏（重庆泰尔森制药有限公司，批号为200101－07）；白扁豆（重庆百味珍药业有限公司，批号为200101）；山药（湖南省松龄堂中药饮片有限公司，批号为200201）；莲子（四川云亳堂药业有限公司，批号为190701）；南山楂（梧州市亳海药业有限公司，批号为E081a1301010）；六神曲（麸炒，四川辅正药业有限公司，批号为151019）；炒麦芽（安徽敬道生物科技有限公司，批号为171102）；玉竹（北京同仁堂＜安国＞有限责任公司，批号为200401）；桔梗（江西和硕药业有限公司，批号为190801）；砂仁（四川和顺康药业有限公司，批号为171102）；甲醇、乙腈均为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 陈皮 TLC 鉴别

取橙皮苷对照品适量，加甲醇制成质量浓度为0.5mg／mL的对照品溶液。取样品1 g，精密称定，剪碎，加甲醇50 mL，超声处理（功率为 800 W，频率为 40 kHz）45 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL 使溶解，作为供试品溶液。按小儿健脾丸处方和工艺制备缺陈皮的阴性样品，并按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。分别吸取 2 μL 供试品溶液和阴性对照品溶液、10 μL 对照品溶液，点于 0.1% NaOH 硅胶 G 板上。按 2020 年版《中国药典（四部）》0502 项下薄层色谱法试验，以乙酸乙酯 － 甲醇 － 水溶液（100 ∶17 ∶10，V ／ V ／ V）为展开剂，展开13 cm，取出，晾干，喷以5% AlCl3试液，加热5 min，置紫外光灯（365 nm）下检视。结果供试品溶液色谱图中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，且阴性对照无干扰。色谱图见图1。

图1 薄层色谱图1.Negative reference solution 2 － 4.Test solution 5.Hesperidin reference solutionFig.1 TLC chromatograms

2.2 甘草酸含量测定

2.2.1 色谱条件［3］

色谱柱：Agilent Zorbax SB－C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），流动相：乙腈 － 0.2% 磷酸水溶液（35 ∶65，V ／ V）；流速：1.0 mL ／ min；检测波长：250 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。

2.2.2 溶液制备

取甘草酸铵对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度为 0.05 mg ／mL 的对照品溶液。取样品 1 g，剪碎，精密称定，加甲醇25 mL，超声处理（功率为800 W，频率为40 kHz）45 min，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按处方工艺制备缺甘草的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.2.3 方法学考察

专属性试验：取2.2.2 项下对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各适量，按2.2.1 项下色谱条件进样测定，结果供试品溶液色谱图中，在与甘草酸铵对照品溶液色谱相同保留时间处有色谱峰出现，且阴性对照无干扰，表明方法专属性良好。色谱图见图2。

图2 高效液相色谱图1.ammonium glycyrrhizinateA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.2 HPLC chromatograms

线性关系考察：分别吸取2.2.2 项下对照品溶液2，3，5，10，15 mL，置 20 mL 容量瓶中，加甲醇稀释并定容，按2.2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以甘草酸铵对照品溶液进样量（X，μg）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程 Y ＝7 640.2 X ＋0.243 5（r ＝ 0.999 9，n ＝ 5）。结果表明，甘草酸铵进样量在 0.004 9 ～ 0.036 9 μg 范围内与峰面积线性关系良好。

检测限及定量限确定：精密吸取甘草酸铵对照品溶液（质量浓度为 0.153 9 μg ／mL）10 μL，按 2.2.1 项下色谱条件进样测定。以信噪比（S／ N）为 3 ∶1 时的含量为检测限，以 S／ N 为10 时的含量为定量限，结果甘草酸铵的检测限和定量限分别为1.39 ng 和4.64 ng。

精密度试验：精密吸取2.2.2 项下对照品溶液适量，按2.2.1 项下色谱条件进样测定6 次，记录峰面积。结果的 RSD 为1.09%，表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一批（批号为19010721）样品6 份，按 2.2.2 项下方法制备供试品溶液，按 2.2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算含量。结果的 RSD为 0.70%（n ＝6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取同一批（批号为19010721）样品，依法制备供试品溶液，分别于室温下放置 0，2，4，6，12，24 h 时按2.2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果的 RSD 为 0.47%（n ＝ 6），表明供试品溶液在室温放置24 h 内稳定。

加样回收试验：取已知含量的样品（批号为19010721）6 份，精密称定，置锥形瓶中，精密量取对照品溶液（质量浓度为 0.024 6 mg ／mL）1 mL，按 2.2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算回收率。结果见表1。

表1 甘草酸铵加样回收试验结果（n ＝6）Tab.1 Results of the recovery test of ammonium glycyrrhizinate（n ＝6）

2.2.4 样品中甘草酸含量测定

取 3 批（批号分别为 19010721，19010722，19010723）样品，按 2.2.2 项下方法制备供试品溶液，按 2.2.1 项下色谱条件进样测定3 次，记录峰面积，并计算样品中甘草酸的含量（甘草酸含量＝甘草酸铵含量／1.020 7）。结果样品中甘草酸的含量分别为 0.386 3，0.386 5，0.387 3 mg ／g，平均含量为 0.386 7 mg ／g。

3 讨论

3.1 TLC 条件选择

参考 2020 年版《中国药典（一部）》和文献［4 －16］，考察了7 个常见的且展开效果较好的展开系统，即乙酸乙酯－甲醇－水，甲苯－乙酸乙酯－甲酸－水的上层溶液，三氯甲烷－甲醇－水在10 ℃以下过夜的下层溶液，乙酸乙酯－甲醇－水，醋酸乙酯－甲醇－水－浓氨溶液，乙酸乙酯－甲醇－水，醋酸乙酯－丁酮－甲酸－水，甲酸乙酯－甲醇－水，结果以乙酸乙酯－甲醇－水为展开剂时的效果最好。考察了2 种展开方法：1）使用乙酸乙酯 － 甲醇 －水（100 ∶17 ∶13，V ／ V ／ V）展开，甲苯 －乙酸乙酯 － 甲酸 －水（20 ∶10 ∶1 ∶1，V ／ V ／ V ／ V）上层溶液进行二次展开；2）乙酸乙酯 － 甲醇 － 水（100 ∶17 ∶10，V／ V／ V）。结果一次展开时图谱更清晰，影响因素较少。考察了自制硅胶G 板、市售硅胶G 板和自制碱板，结果比移值均在 0.2 ～ 0.8 之间，展开效果较好。故 TLC 条件确定为于乙酸乙酯－甲醇－水溶液中一次展开，点样于 0.1%NaOH 硅胶 G 板上。

3.2 甘草提取方法选择

考察了水浴加热回流提取和超声提取2 种方法，分别精密加入30%，50%，70%，95%甲醇溶液各50 mL，回流提取和超声提取30，45，60 min。在水浴加热回流提取法中，提取率随回流时间、乙醇和甲醇浓度的增加而增加，95%甲醇回流30 min 时提取效果最佳；在超声提取法中，提取率随甲醇浓度、超声时间的增加而增加，95%甲醇超声45 min 时提取效果最佳。考虑回流提取比超声提取复杂，最终以95%甲醇超声提取45 min 为提取方法。

3.3 HPLC 条件选择

考察了流动相乙腈－0.2%磷酸水溶液的3 种比例（37 ∶63，35 ∶65，36 ∶64， V ／ V），结果目标峰均能较好分离，但流动相比例为 35 ∶65（ V ／ V）的分离度更好，且峰形对称，符合系统适用性试验要求。考察了不同色谱柱温度（20，25，30 ℃）及不同品牌色谱柱（Waters RP －C18柱、Insert Sustain C18柱、Agilent Zorbax C18柱，规格均为250 mm ×4.6 mm，5 μm）对含量测定结果的影响，结果色谱柱温度和品牌不影响含量测定结果，故最终确定2.2.1 项下色谱条件。

3.4 方法评价

该方法操作简便，结果准确，专属性强，稳定性和重复性均较好，可用于小儿健脾丸的质量控制。