王晓敏，常 娟，王 平，尹清强 ，杨明凡，朱 群，胡骁飞，王全亮

（1.河南农业大学动物科技学院，河南郑州 450046；2.河南农业大学动物医学院，河南郑州 450046；3.河南德邻生物制品有限公司，河南新乡 453000；4.河南省农业科学院动物免疫学重点实验室，河南郑州 450002；5.河南广安生物科技股份有限公司，河南郑州 450001）

霉菌毒素广泛存在于自然界中，是由霉菌产生的有毒次级代谢产物（Hisako 等，2013），目前大约有100 多种真菌产生300 多种霉菌毒素（Pereira 等，2014）。我国是一个农业大国，小麦、玉米、花生等都是我国的主要农产品，但与此同时，我国也是霉菌毒素污染问题较为严重的国家之一。2018 年中国饲料和原料中霉菌毒素污染情况调查报告显示，我国99.49%的饲料和原料存在霉菌毒素污染问题，其中85%以上的饲料和原料被2 种或2 种以上的霉菌毒素污染（雷元培等，2018）。饲料中常见且危害较大的霉菌毒素有黄曲霉毒素B1（AFB1）、玉米赤霉烯酮（ZEA）和呕吐毒素（DON）等。这三种霉菌毒素能够降低机体免疫力，具有致癌性、基因毒性和生殖毒性等，可严重危害机体健康（黄珂等，2019；刘艳丽等2012；Meissonmmier 等，2006；Wang 和 Groopman，1999），而且这些霉菌毒素的叠加毒性远大于单一毒素的作用（韩文格和高建峰，2019）。因此，关于消除霉菌毒素危害的研究受到越来越广泛的关注。传统的物理和化学方法对于霉菌毒素的去除有一定的局限性，物理方法主要靠蒙脱石等的吸附功能，但存在着吸附谱窄、效价低、解吸附及吸附维生素和矿物元素等营养物质的缺点；化学方法通常会影响饲料的营养品质和适口性，降低饲料利用率，并存在安全隐患（Cao 等，2011；Yiannikouris 和Jouany，2002），难以大规模在生产中应用。生物解毒法包括微生物降解法和酶解法，具有高效、特异性强、环境友好、污染小的特点，因此近些年来成为人们研究的热点（蔡俊等，2017）。赵雪芹等（2020）选择迟缓芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、罗伊氏乳杆菌、乳酸片球菌、嗜热链球菌和米曲霉6 种益生菌来降解ZEA 和DON，结果表明，迟缓芽孢杆菌对DON 降解率达到79.59%，对ZEA 降解率达到46.93%。Shetty 等（2007）筛选出了两株酿酒酵母，对AFB1的吸附能力分别为38.7%和36.1%，并提出起吸附作用的是其细胞壁上的碳水化合物或甘露聚糖。刘畅等（2010）筛选出了一株对AFB1的吸附率高达81.16%的酿酒酵母。郑文秀等（2019）驯化的酪丁酸梭菌菌株对ZEA 的吸附率可达98.5%。这些都是利用益生菌去除单一霉菌毒素的研究，但实际生产中，一种饲料或饲粮往往受到多种霉菌毒素污染。其协同或叠加毒性对动物健康和生产性能的影响比单一霉菌毒素单独作用的危害更大（李彦伸等，2020）。鉴于此，本研究通过将具有解毒功能的枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、丁酸梭菌与霉菌毒素降解酶进行高效组合，研究其对AFB1、ZEA 和DON 三种霉菌毒素的联合降解作用，为多种霉菌毒素的同步生物降解提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 AFB1和ZEA 购自Sigma 公司，DON 购自上海源叶生物科技有限公司，AFB1和ZEA 定量检测试剂盒购自德国R-BiopHarm 公司，DON 定量检测试剂盒购自江苏省苏微微生物研究有限公司。枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、丁酸梭菌和产生霉菌毒素降解酶的米曲霉均由河南农业大学动物营养与饲料生物技术研究室保存。

1.2 培养基的配制 LB 培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，NaCl 10 g/L。YPD 培养基：蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，葡萄糖20 g/L。丁酸梭菌培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉3 g/L，牛肉膏10 g/L，葡萄糖5 g/L，氯化钠5 g/L，乙酸钠3 g/L，可溶性淀粉1 g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5 g/L，pH为6.8 g/L。PDA 培养基：葡萄糖20 g/L，可溶性淀粉6 g/L，酵母浸粉2 g/L，硫酸镁0.3 g/L，磷酸二氢钾1 g/L，蛋白胨5 g/L。上述培养基为固体时需要再加入2%琼脂，用蒸馏水定容至1 L，在121 ℃、1.035×105Pa 条件下高压蒸汽灭菌20 min 备用。米曲霉固体发酵培养基：麸皮∶豆粕∶玉米=7∶2∶1，固体：蒸馏水=5∶3，灭菌方法同上。

1.3 菌种的活化与培养 将实验室保存的枯草芽孢杆菌接种到LB 培养基上，37 ℃、180 r/min条件下摇床振荡培养24 h；酿酒酵母接种到YPD培养基上，30 ℃、180 r/min 条件下摇床振荡培养24 h；丁酸梭菌接种到丁酸梭菌培养基上，37 ℃静置状态下培养24 h 后，分别按2%的接种量接入对应高压灭菌后的新鲜培养基，再次培养24 h。菌种用平板涂布法测定活菌数，统一调整活菌数至1×108cfu/mL，活菌数用自然对数值lg 表示，菌种保存于4 ℃备用。

霉菌毒素降解酶的制备：挑取实验室保存的米曲霉菌株，将其涂布于PDA 平板上，30 ℃静置培养，3～5 d 有大量米黄色孢子产生，在平皿中加入5 mL 的灭菌生理盐水，用涂布棒将平板上的孢子刮下，将其转移至高压灭菌过的米曲霉固体发酵培养基中并搅拌均匀，30 ℃静置培养3～5 d，待有大量孢子产生时晾干。按照固液比1∶20 的比例，将米曲霉固体发酵培养物与生理盐水混匀，搅拌2 h 后再静置2 h，将浸泡液先用8 层纱布过滤，之后滤液在12000 r/min 条件下离心10 min，最后用0.22 μm 的滤膜过滤除菌后，保存于4 ℃冰箱待用。

1.4 复合益生菌最佳配伍比例的确定 采用拉丁方三因素三水平试验设计，枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、丁酸梭菌为拉丁方试验设计的三个因素，1×105、1×106、1×107cfu/mL 为三种益生菌的三个活菌数水平。构建得到9 种复合微生物菌株组合来筛选优化益生菌组合，试验分组见表1。根据本实验室以前的研究结果，设置了高剂量毒素组（AFB1、ZEA、DON 分别为30、150、1500 μg/L）和低剂量毒素组（AFB1、ZEA、DON 分别为10、150、600 μg/L）。反应体系为5 mL，试验组根据试验设计加入3 mL MRS 培养基和1.5 mL 复合益生菌菌液，用生理盐水调至5 mL。以相同体积的MRS培养基加等剂量的三种霉菌毒素作为空白对照，每个处理3 个重复，各组置于37 ℃、100 r/min 恒温摇床中振荡培养24 h，以AFB1、ZEA、DON 的降解率作为参考指标，优化得到复合益生菌的最优添加比例。

1.5 益生菌组合与霉菌毒素降解酶配伍对AFB1、ZEA、DON 的降解 根据表1 设计得到同时对AFB1、ZEA 和DON 降解效果最优的益生菌组合后，把复合益生菌的量定为1.5 mL，霉菌毒素降解酶的用量分别为0.05、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，最后用MRS 培养基调至5.0 mL。每个处理3 个重复，各组置于37 ℃、100 r/min 恒温摇床中振荡培养24 h，测定各组AFB1、ZEA、DON 三种毒素的降解率。

表1 复合益生菌降解AFB1、ZEA、DON 拉丁方试验设计 lg cfu/mL

1.6 三种霉菌毒素降解率测定与计算 反应结束后，发酵液在10000 r/min 条件下离心5 min，取上清液按照检测试剂盒步骤说明进行AFB1、ZEA、DON 降解率测定。AFB1降解率/%=（24 h 对照组AFB1含量-24 h 试验组AFB1含量）/24 h 对照组AFB1含量×100；ZEA 和DON 降解率的计算方法同上。

1.7 数据统计分析 试验数据经Excel 初步整理后，采用SPSS 25.0 软件进行One way ANOVA单因素方差统计分析，利用Duncan’s 法进行多重比较，测定复合益生菌与霉菌毒素降解酶配伍对AFB1、ZEA、DON 的降解效果。所有结果均以“平均值±标准差”表示，以P ＜0.05 表示差异显著，P ＞0.05 表示差异不显著。

2 结果

2.1 高毒素组复合益生菌对AFB1、ZEA、DON三种毒素的降解效果 由表2 可知，高剂量霉菌毒素处理中，试验1 组AFB1和DON 降解率最高，分别达到了40.55%和47.22%（P ＜0.05）。虽然试验1 组ZEA 的降解率为56.05%，不是最高，但与ZEA 降解率最高组差异不显著。把AFB1、ZEA 和DON 降解率相加得三者总降解率，试验1组AFB1、ZEA 和DON 总降解率为143.83%，显著高于其余各组（P ＜0.05）。各因素对霉菌毒素降解率影响的主次关系为A（枯草芽孢杆菌）＞B（酿酒酵母菌）＞C（丁酸梭菌）。极差分析显示枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、丁酸梭菌最优添加比例为A1B1C1，即1×105、1×105、1×105cfu/mL，与试验结果一致。表3 的结果显示该试验结果有效，其中A（枯草芽孢杆菌）对三种霉菌毒素的同步降解贡献最大（P ＜0.01），与表2 的结果一致。

表2 高毒素组益生菌不同配伍对AFB1、ZEA 和DON 的降解率（n=3）

表3 各因素之间的主体效应分析

2.2 低毒素组复合益生菌对AFB1、ZEA、DON三种毒素的降解效果 由表4 可知，低剂量霉菌毒素处理中，试验1 组AFB1降解率最高为43.05%（P ＜0.05），虽然该组ZEA 和DON 的降解率不是最高，但与最高组差异不显著（P ＞0.05）；该组AFB1、ZEA 和DON 降解率相加，得到霉菌毒素总降解率最高，为161.8%（P ＜0.05）。因而，仍把试验1 组作为三种霉菌毒素降解的最佳组。各因素对霉菌毒素降解率影响的主次关系为A（枯草芽孢杆菌）＞B（酿酒酵母菌）＞C（丁酸梭菌）。极差分析显示枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、丁酸梭菌最优添加比例为A1B1C1，即1×105、1×105、1×105cfu/mL，与试验结果一致。表5 的结果显示，该试验结果有效，其中因素A（枯草芽孢杆菌）和B（酿酒酵母菌）对三种霉菌毒素的同步降解贡献最大（P ＜0.01）。

表4 低毒组益生菌不同配伍比例对AFB1、ZEA、DON 的降解率（n=3）

表5 各因素之间的主体效应分析

2.3 高毒素组复合益生菌与霉菌毒素降解酶配伍对AFB1、ZEA 和DON 三种毒素的降解效果 由表6 可知，在高剂量霉菌毒素的降解试验中，单一复合益生菌、单一霉菌毒素降解酶及复合益生菌与霉菌毒素降解酶比例为30∶1 时，对三种霉菌毒素的总降解率最高，分别到达了190.08%、175.10%和184.44%，显著地高于其他组（P ＜0.05）。

表6 高毒素组复合益生菌与霉菌毒素降解酶配伍对AFB1、ZEA 和DON 的降解率（n=3）

2.4 低毒组复合益生菌与霉菌毒素降解酶配伍对AFB1、ZEA、DON 三种毒素的降解效果 由表7 可知，在低剂量霉菌毒素的降解试验中，单一霉菌毒素降解酶对三种霉菌毒素的总降解率最高，达到了219.23%（P ＜0.05）；其次为单一复合益生菌、复合益生菌与霉菌毒素降解酶比例为30∶1 和3∶2 时，对三种霉菌毒素的总降解率较高，分别达到了178.07%、181.84%和170.33%，显著高于其他组（P ＜0.05）。

表7 低毒素组复合益生菌与霉菌毒素降解酶配伍对AFB1、ZEA 和DON 的降解率（n=3）

3 讨论

3.1 复合益生菌对AFB1、ZEA 和DON 三种霉菌毒素的降解效果 许多学者对如何消除霉菌毒素对畜禽健康和生产性能的不良影响，降低霉菌毒素及其代谢产物在畜产品中的残留等方面作了大量研究。结果证明，微生物降解对霉毒素的去除效果要优于传统的物理和化学脱毒方法（张俊南等，2019；刘水灵等，2018；Farbo 等，2016；李文明，2013）。梁含等（2019）从土壤和发霉秸秆等材料中筛选的淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌对DON 的降解率分别为19.1%和51.3%。将两种菌株组合后对DON 的降解率可达71%。何润霞（2016）筛选出14 株降解ZEA 的细菌，其中一株红球菌对ZEA 降解率达87.1%。研究已经证实，许多真菌能够将AFB1降解成低毒或无毒的产物（王佳兴等，2020；Rushing 和Selim，2018）。本研究结果表明，将枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、丁酸梭菌进行有效配伍，可有效同步降解AFB1、ZEA 和DON，优于前人对单一毒素的降解，更切合生产实际。这些复合益生菌除具有降解多种霉菌毒素外，还具有调节动物胃肠道微生物区系，提高机体健康和免疫力的功效，对于畜牧业的健康和安全生产意义重大。

3.2 复合益生菌与霉菌毒素降解酶配伍对AFB1、ZEA 和DON 的降解效果赵雪芹等（2020）将米曲霉与AFB1共培养，AFB1降解率为46.93%。左瑞雨（2012）筛选到一株米曲霉，其所分泌的酶制剂对AFB1降解率达到77.0%，当该酶制剂与枯草芽孢杆菌、乳酸菌和酵母菌配伍后，可更有效地降解AFB1（左瑞雨等，2018）。王开萍等（2015）从土壤样品中筛选出一株能够降解DON的米曲霉，降解率达到60%以上。刘超齐（2017）等将复合益生菌（枯草芽孢杆菌K3、枯草芽孢杆菌K4 和产朊假丝酵母）与来自米曲霉的霉菌毒素降解酶配比为2∶1 时，对ZEA 降解率达到95.15%。米曲霉在发酵培养过程中可以产生多种酶系，能够促进动物对营养物质的消化吸收利用，其分泌的胞外酶还可以降解多种霉菌毒素（Garda-Buffon 和Badiale-Furlong，2010）。通过复合益生菌与霉菌毒素降解酶的配伍试验可以看到，无论是高剂量或是低剂量霉菌毒素存在，单一的复合益生菌或者单一的霉菌毒素降解酶都可提高其对AFB1、ZEA 和DON 总降解率。虽然复合益生菌与霉菌毒素降解酶的配伍也可以提高AFB1、ZEA 和DON 总降解率，但是两者配伍的优势没有体现出来。考虑到该产品未来将在动物胃肠道发挥作用，因而单一复合益生菌、单一霉菌毒素降解酶及适宜的复合益生菌与霉菌毒素降解酶配伍，都将会在多种霉菌毒素的同步降解中发挥重要作用，对畜禽健康养殖和畜产品安全生产具有重要意义。

4 结论

本试验结果表明，复合益生菌、霉菌毒素降解酶或两者适宜的配伍均能有效降解AFB1、ZEA 和DON，为畜牧业和饲料业生产中消除多种霉菌毒素对动物的危害奠定了基础。