章烨雯，吕其壮，陈 荣，樊燕萍，臧青民

（玉林师范学院生物与制药学院，广西玉林 537000）

四时青又名云实叶，为豆科云实属植物云实的干燥叶片（魏小华，2012），具有清热解毒，祛瘀止痛等功效，也可在一定程度上维持动物体内的代谢平衡，防治疾病，目前已有研究将其作为饲料添加剂使用（王文辉等，2017；田志超等，2012）。四时青化学成分复杂多样，主要含有萜类、黄酮类及生物碱等，其中高异黄酮和卡萨烷二萜类为特征性成分（Yuben 等，2018）。黄酮类化合物作为普遍存在于植物中的一类成分，具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗菌和免疫调节等生物活性（吴兆华等，2007）；另外，其作为饲料添加剂能促进动物健康育肥，增强动物的免疫力，同时提高肉类品质（冯香安等，2011）。目前对于四时青的研究主要集中在化学成分和生物活性上（李昌勤等，2016；李茂星等，2002），但对其黄酮类成分提取工艺的研究鲜有报道。因此，本试验在参考相关植物总黄酮提取工艺的基础上（唐春伟等，2019），采用单因素结合正交试验，研究四时青总黄酮的最佳提取工艺，以期为进一步开发四时青提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 电子天平（JA2003，舜宇恒平）；新型密封式粉碎机（雷迈）；数码超声波清洗器（KQ-500DV，昆山）；数显恒温水浴锅（HH-2，国华）；旋转蒸发仪（RE-2000A，亚荣）；循环水式多用真空泵（SHB-III，长城科工贸）；紫外可见分光光度计（A360，翱艺）。

四时青采摘于广西南宁上林县的一丘陵地，经鉴别为豆科，云实属植物云实的叶；芦丁标准品购于上海源叶生物科技有限公司；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、无水乙醇等试剂均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 芦丁标准曲线的绘制 精密称定芦丁标准品20.0 mg，置于100 mL 量瓶中，用60%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得0.2 mg/mL 芦丁标准溶液。分别精密量取芦丁标准溶液0.00、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL 置100 mL 容量瓶，添加60%乙醇至25 mL；分别加入5%亚硝酸钠溶液1.5 mL，摇匀，静置6 min；再加入10% 硝酸铝溶液1.5 mL，摇匀，静置6 min；最后加入4% 氢氧化钠溶液20 mL，用60%乙醇定容至刻度，摇匀，静置12 min。用紫外分光光度计（λ=510 nm）测定不同浓度芦丁标准品溶液的吸光度值，以浓度（C)为横坐标、吸光度（A)为纵坐标绘制芦丁标准曲线（黄明堦等，2009）。

1.2.2 四时青总黄酮提取率的测定 根据芦丁标准曲线计算样品中总黄酮的质量浓度，提取率按下式计算：

式中：C 为四时青总黄酮的质量浓度，mg/mL；N 为稀释倍数；V 为样品液体积，mL；M 为样品质量，g；T 为四时青总黄酮的提取率，%。

1.2.3 单因素试验 以四时青总黄酮的提取率为指标，分别设置乙醇浓度（40%、50%、60%、70%、80%）、提取时间（15、30、45、60、75min）和溶剂倍量（5、10、15、20、25）为考察因素和水平，筛选出影响四时青总黄酮提取的较优水平。

1.2.4 正交试验 在单因素试验的基础上，以四时青总黄酮的提取率为考察指标，采用L9（34）正交表安排试验，因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平

1.3 数据处理与分析 采用SPSS 20.0 软件对正交试验数据进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制 以芦丁的质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标进行线性回归，得回归方程y=11.864x-0.0019（R2=0.9994），结果见图1。表明芦丁在0.004～0.040 mg/mL 与吸光度呈良好的线性关系。

图1 芦丁标准曲线

2.2 单因素试验结果

2.2.1 乙醇浓度对四时青总黄酮提取率的影响乙醇作为一种常用的绿色溶剂，可以满足不同类别成分的提取需要，渗透力强。如果乙醇的浓度过小容易导致水溶性杂质的溶出，如果过大容易导致色素、树脂等脂溶性杂质的溶出。本单因素试验固定溶剂倍量15、提取时间60 min，研究系列乙醇浓度对四时青总黄酮提取率的影响，结果见图2。在一定浓度范围内，随着乙醇浓度的升高，四时青总黄酮的提取率增大，但当乙醇浓度大于60%时，由于四时青中叶绿素、苷元等杂质的溶出量增加，从而影响总黄酮的提取。

图2 乙醇浓度对提取率的影响

2.2.2 提取时间对四时青总黄酮提取率的影响提取过程的完成需要一定的时间，即有效成分溶出、扩散达到平衡的时间。时间太短，有效成分浸出不完全，时间太长，造成浪费，导致无效成分和杂质溶出增加，甚至使有效成分降解失活。本单因素试验固定溶剂倍量15，乙醇浓度60%，研究不同提取时间对四时青总黄酮提取率的影响，结果见图3。随着提取时间的增加，四时青总黄酮的提取率增大，但当提取时间超过60 min 时，由于四时青中其他化合物也会溶出，从而影响总黄酮的提取。

图3 提取时间对提取率的影响

2.2.3 溶剂倍量对四时青总黄酮提取率的影响溶剂用量的加大，有效成分可以充分扩散，但用量过大也会给后续工艺操作带来不便。本单因素试验固定提取时间60 min，乙醇浓度60%，研究不同溶剂倍量对四时青总黄酮提取率的影响，结果见图4。随着溶剂倍量的增加四时青总黄酮的提取率增大，但当溶剂倍量大于10 时，总黄酮溶出不再增加。

图4 溶剂倍量对提取率的影响

2.3 正交试验结果

2.3.1 正交试验设计 正交试验设计及分析结果见表2。由极差分析可知，溶剂倍量和乙醇浓度对四时青总黄酮提取影响较大，各因素主次顺序为：溶剂倍量＞乙醇浓度＞提取时间，较优提取工艺为A2B2C2。

表2 四时青总黄酮正交试验设计及结果

2.3.2 方差分析 由表3 可知，B、C 对总黄酮提取率影响显著（P ＜0.05），A 对总黄酮提取率影响不显著（P ＞0.05），影响四时青总黄酮提取率的主次因素为C ＞B ＞A，与表2 中分析结果相同。因此四时青总黄酮的最佳提取工艺条件为：提取时间60 min，乙醇浓度60%，溶剂倍量10 倍。

表3 正交试验方差分析

2.3.3 提取条件的验证 为验证工艺的的准确性和合理性，按上述最优工艺进行提取，平行操作3 份，分别测定吸光度值，计算总黄酮提取率。结果显示，最优工艺下，四时青总黄酮平均提取率为23.82%，RSD 为1.64%，说明该提取工艺稳定、可行。

2.4 提取次数的确定 由于提取次数对正交试验结果影响较大，因此在筛选出最佳条件后对其单独考察。按正交试验确定的工艺提取四时青，平行操作3 份，每份分别提取2 次，2 次的提取液分别单独处理，测定总黄酮的提取率，结果见表4。提取2 次与提取1 次相比，总黄酮提取率仅增加了3.04%，结合工业生产成本，四时青总黄酮的提取次数确定为1 次。

表4 四时青总黄酮提取次数考察%

3 结论

由单因素试验和正交试验结果可知，各因素中溶剂倍量对四时青总黄酮提取率影响最大，其次是乙醇浓度，对提取率影响最小的是提取时间。得到四时青总黄酮最佳提取工艺条件为：提取时间60 min，乙醇浓度60%，溶剂倍量10 倍，此条件下总黄酮提取率为23.82%，RSD 为1.64%，表明该提取工艺条件稳定、可行。