彭轶楠，季 彬，巩晓芳，穆永松，叶 泽，杜津昊，席 鹏，王治业

（1.甘肃省科学院生物研究所，甘肃省微生物资源开发利用重点实验室，甘肃兰州 730000；2.甘肃华瑞农业股份有限公司，甘肃民乐 734502）

酵母是一种营养保健为一体的生物活性添加剂，广泛应用于饲料中（付双喜，2001），其可富集微量元素，具有稳定性，能与饲料中其他成分很好地协同配伍，可避免饲料中营养成分的流失（肖竞等，2004)。酵母硒已被当作天然硒源添加到饲料中，研究证明，酵母硒对畜禽硒的补充效果比硒酸钠盐高3～6 倍（白晓婷，2005）。硒酵母中除富含硒外，还含有易被畜禽吸收的必需氨基酸、维生素和矿物元素等各种营养成分，能够促进畜禽的生长发育，缩短饲养期，节约精饲料（Bronzetti 等，2001），有效提高反刍动物瘤胃发酵功能（Wei 等，2019；Genther 等，2015），促进反刍动物泌乳功能（Sun 等，2017；呼显生等，2012），提高肉产品的品质和营养价值（郭璐等，2020；刘阿云，2019）。

酵母细胞可以将通过硫代谢途径进入细胞的SeO32+转化成硒代小分子有机化合物，包括硒代蛋氨酸、硒代胱氨酸和硒甲基半胱氨酸（Kieliszek等，2016）。硒代蛋氨酸被认为是酵母硒中有机硒的主要形式（Kelly 等，1995），与无机硒相比，具有生物利用率高、毒副作用小等优点，在动物生产中，相同的添加水平可起到更为显著的效果（张少涛等，2020；郭永清等，2019）。硒代蛋氨酸具有抗氧化作用，可提高畜禽硒的利用率（Kang 等，2015；袁施彬，2007），增加体内抗体水平，从而促进免疫功能（徐伟风等，2018；Carlson 等，2011），具有抗肿瘤和防治心血管疾病（Zhao 等，2007；Waters 等，2003）等功效。

本试验通过研究不同时间添加不同浓度硒对酵母生长的影响，初步确定适宜的硒添加时间和添加浓度范围，测定酵母细胞总硒和细胞内蛋白硒，进一步明确硒添加时间和添加量与酵母富集硒含量的关系。利用高效液相色谱串联质谱法HPLCMS 法测定酵母细胞硒代氨基酸的含量，旨在探明硒浓度对酵母细胞硒代氨基酸含量的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），保存于本实验室。

1.1.2 培养基 酵母浸出粉胨葡萄糖培养基（YEPD）：葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母浸粉10 g，琼脂粉20 g，蒸馏水1000 mL，pH 自然，121 ℃高压灭菌20 min。

裂解液：50 mmol/L 磷酸二氢钠，1 mmol/L EDTA-2Na，5%甘油，pH 7.4。

磷酸缓冲盐（PBS）缓冲液：NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO41.44 g，KH2PO40.24 g，溶于900 mL 双蒸水中，盐酸调pH 至7.4，加水定容至1000 mL，常温保存备用。

1.2 主要试剂和设备 亚硒酸钠、硝酸、高氯酸、乙腈、3，3'-二氨基联苯胺（DBA）均为优级纯，购自上海国药集团化学试剂有限公司；葡萄糖、蛋白胨、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）、甲酸、甲苯、硫酸铵、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾，购自北京奥博星生物技术有限责任公司。

1100 高效液相色谱系统（美国安捷伦公司）、6410 三重串联四极杆质谱（美国安捷伦公司），恒温培养箱（上海一恒），振荡培养箱（上海博迅），紫外分光光度计（上海普析），超声破碎仪（宁波新芝），水浴锅（上海赫田），电热恒温干燥箱（广州康恒），冷冻高速离心机（长沙湘仪）等。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种活化 将菌种接于固体斜面YEPD 培养基活化24 h 后，取一环于YEDP 液体培养基摇瓶中，在温度30 ℃、转速200 r/min 条件下培养24 h 作为活化的菌种。

1.3.2 硒添加浓度对酵母生长的影响 配制亚硒酸钠溶液，经过滤除菌后添加至无菌YEPD 液体培养基中，使培养基中Se2+浓度分别为0、10、15、20、30、40 mg/L，酵母菌以1%接种量分别接种于含Se2+的YEPD 培养基中，温度30 ℃、转速200 r/min条件下培养48 h。培养期间，采用分光光度计法，每6 h 于波长600 nm 条件下测定不同Se2+浓度培养液的OD600nm值，绘制菌株的生长曲线。

1.3.3 硒添加时间对酵母生长的影响 酵母菌以1%接种量接种于YEPD 培养基中，分别在0、2、4、6、8、10 h 添加无菌亚硒酸钠溶液，使培养基Se2+终浓度为20 mg/L，在温度30 ℃、转速200 r/min 条件下培养48 h。培养期间，采用上述方法测定培养液的OD600nm值，绘制菌株的生长曲线。

1.3.4 硒含量的测定 采用3，3'-二氨基联苯胺分光光度法测定硒含量（娄兴丹等，2017）。将含硒溶液添加于100 mL 烧杯中，加水补至40 mL。加入适量2 mol/L 甲酸，使溶液pH 为2.0～3.0，加入5% EDTA-2Na 溶液4 mL 掩盖干扰离子。再加入0.5% 3，3'-二氨基联苯胺（DBA）溶液2 mL，摇匀后放置65 ℃恒温水浴锅中避光反应30 min。取出后用浓氨水调节pH 为7.0～7.5，转入分液漏斗中，加入10 mL 甲苯萃取，剧烈振荡2 min，静置3～4 min 待分层，弃水层，将甲苯层通过脱脂棉过滤到试管中待用。用分光光度计在波长420 nm 处测定吸光度，平行测定3 次，计算吸光度的平均值，采用甲苯做空白对照。

1.3.5 酵母总硒含量的测定 称取烘干的含硒酵母0.1 g 于烧杯中，加入10 mL 混酸溶液（硝酸：高氯酸=4：1，V/V），在电热板上加热消解，直至溶液变为透明淡黄色为止，倒入25 mL 容量瓶，加去离子水补足，每次取10 mL 溶液作为待测样品。测定方法同1.3.4，通过标准曲线计算样品单位硒含量，计算公式为：

单位硒含量/（μg/g）=标准曲线查得样液的硒浓度（μg/mL）×样液体积（mL）/样品质量（g）；

总硒含量/（μg/L）=菌体生物量（g/L）×单位硒含量（μg/g）。

1.3.6 酵母生物量的测定 将酵母发酵液于转速为5000 r/min 条件下离心20 min，收集菌体沉淀，用无菌蒸馏水洗3 次，将菌体沉淀放置烘箱85 ℃烘干至恒重，称重记录。

1.3.7 酵母硒蛋白的提取 称取烘干的含硒酵母1.0 g，加入15 mL 裂解液中，振荡混匀后，在冰浴条件下超声30 min（30 W，20 KHz）后，在4 ℃条件下10000 r/min 离心20 min 收集沉淀，加入硫酸铵溶液直至饱和，在4 ℃条件下10000 r/min 离心10 min，将沉淀溶解到PBS 缓冲液，置于透析袋中，于去离子水中透析去除残余硫酸铵，收集透析后的蛋白液为待测样液。

1.3.8 酵母细胞硒代氨基酸的测定 采用高效液相色谱串联质谱（HPLC-MS）法对硒蛋白进行分析，色谱工作条件：ZORBAX 300A SB-C 18 色谱柱（100 mm×2.1 mm，3.5 μm）；柱温20 ℃；流动相为20%水＋80% 乙腈，流动相水和乙腈中各含0.1%甲酸；流速为200 μL/min；进样量为10 μL。质谱工作条件：电喷雾离子电离源，正离子电离方式，电离电压3850 V；雾化器为高纯氮气；离子源温度300 ℃；雾化器压力为300 psi；毛细管电压为3800 V，扫描方式为多反应离子监测（MRM）。

2 结果与分析

2.1 硒的添加量对酵母生长的影响 不同硒浓度对酵母的生长有很大影响。从图1 可以发现，随着硒浓度增加，酵母菌OD600nm值逐渐减小，表明硒浓度对酵母生长具有抑制效果。当硒的浓度为10、15 mg/L 和20 mg/L 时，酵母OD600nm值接近，硒浓度为30 mg/L 和40 mg/L 时，OD600nm值明显降低，表明培养基中硒浓度为10、15 mg/L和20 mg/L 时，对酵母的生长影响最小。

图1 不同浓度硒含量对酵母生长的影响

2.2 硒添加时间对酵母生长的影响 在培养基中分别在不同时间添加硒浓度为20 mg/L，对酵母生长的影响见图2，随着加硒时间的增加，酵母生长具有正效应。0～4 h 为酵母生长适应期，在0、2 h 和4 h 加硒对酵母生长影响较大，其中0 h和2 h 加硒酵母OD600nm值最小；4～12 h 为酵母生长对数期，在6、8 h 和10 h 加硒酵母生长OD600nm值均较大，说明加硒时间在生长对数期时对酵母生长影响最小。

图2 不同加硒时间对酵母生长的影响

2.3 不同时间添加不同浓度硒对酵母富集硒的影响 培养基中添加硒不仅对酵母生物量产生影响，对酵母富集硒也具有影响。表1 表明，随着硒浓度的增加，酵母均表现出生物量降低，酵母总硒含量增加，酵母中蛋白硒含量增加的趋势，说明虽然硒对酵母的生长有相对抑制作用，但酵母对硒的富集能力有所增强，表现为酵母细胞总硒和细胞内蛋白硒含量增加。当硒添加量为20 mg/L 时，酵母富集硒含量最高。

表1 不同时间添加不同浓度硒对酵母富集硒的影响

随着加硒时间的增加，酵母也均表现出生物量增加，酵母总硒含量降低，酵母中蛋白硒含量降低的规律，说明较晚时间添加硒虽然有益于酵母生长，但酵母富集硒含量却明显降低，当在6 h 添加硒时，酵母总硒和细胞内蛋白硒含量最高。由于在6～12 h 为酵母生长对数期，因此选择在6 h为最佳添加硒时间。

2.4 酵母细胞中硒代氨基酸的测定 提取酵母细胞蛋白质，蛋白质透析后采用HPLC-MS 联用仪测定硒代蛋氨酸、硒代胱氨酸和硒代甲基半胱氨酸。质谱扫描在m/z184、198 和337 分别出现硒代甲基半胱氨酸、硒代蛋氨酸和硒代胱氨酸的信号峰，经过计算得到各氨基酸含量（表2）。在培养基中添加不同浓度硒，酵母经过富集后细胞内三种硒代氨基酸的含量均有明显升高，进一步说明酵母细胞具有富集硒的能力，并在细胞内将无机的亚硒酸钠转化为硒代氨基酸，外源无机硒含量增加，促进酵母细胞将无机硒转化为硒代氨基酸。硒浓度为10、15 mg/L 和20 mg/L 时，均为硒代蛋氨酸含量最高，其次为硒代胱氨酸，硒代甲基半胱氨酸含量最低，外源硒的添加主要促进了酵母细胞内硒代蛋氨酸的形成，是酵母细胞内含量最高的硒代氨基酸。从表中可以看出，硒添加浓度为20 mg/L 时，三种硒代氨基酸含量均为最高，该浓度为最佳添加量。

表2 不同硒添加量对硒代氨基酸含量的影响 μg/g

3 讨论

酵母菌具有来源广泛、繁殖周期短、营养价值高的特点，是较好的微量元素富集载体菌种（白晓婷，2005）。酵母菌富集微量元素硒，是指将无机硒转化为有机硒，便于动物机体吸受。酵母富集硒的能力受培养过程中硒的添加量、硒添加时间及发酵条件等的影响（丁岚峰等，2009）。李勤等（2009）和孙海云等（2007）研究硒对酵菌生长的影响发现，微量的硒对酵母菌的生长有一定的促进作用，然而过量的硒会抑制酵母菌的生长并且随着硒浓度的增加抑制作用不断增强。Stabnikova 等（2008）研究酵母富集硒指出，在培养基中添加亚硒酸钠5 mg/L 不会对酵母生长产生影响，10 mg/L时酵母生长受到抑制，酵母菌析出红色的单质硒，称为红硒现象。石俊（2013）研究表明，发酵液中硒浓度低于10 mg/L 时对酵母生长没有影响，大于该浓度时酵母生长受到抑制。吴梅（2016）发现，硒添加浓度为15 μg/mL 时开始变红，且富硒能力较强，当添加量到20 μg/mL 时，酵母的颜色变成砖红色，说明亚硒酸钠抑制酵母的生长。本试验中结果与上述结论相似，硒浓度高于20 mg/L 时，酵母菌OD600nm值减小，说明菌株生长受到抑制，硒浓度为20 mg/L 时，酵母总硒含量和细胞内蛋白硒含量均高于10 mg/L 和15 mg/L 硒浓度。

在发酵初期添加亚硒酸钠会抑制微生物生长，过晚添加会影响硒的富集量，微生物发酵的对数期和稳定期是酶活性和代谢水平旺盛的时期，该时期细胞吸收能力最强，随着细胞增殖富硒能力也随之增强。Wang 等（2010）研究酵母富硒能力时发现，添加硒的最佳时间是生长对数期。吴竞等（2012）发现，在酵母生长对数期8 h 添加亚硒酸钠，有机硒的转化率高于其他添加时间。杨丽华等（2006）建议在对数期添加硒，有助于提高酵母生物量和富硒量。本试验在0、2、4、6、8、10 h 添加相同浓度硒，在生长对数期6～10 h 酵母OD600nm值高于稳定期0～4 h，说明在对数期添加硒适宜酵母生长；通过测定酵母富集硒含量发现，在6 h添加硒时，酵母总硒含量和细胞内蛋白硒含量最高，结果与其他学者研究结果相同。

富硒酵母中硒沉积在细胞壁、细胞膜、氨基酸和蛋白质中，其中主要与氨基酸络合成蛋白质，包括硒代蛋氨酸、硒代胱氨酸和硒代甲基半胱氨酸。这些硒蛋白毒性小，生物利用率高，是动物获得硒的主要来源，对富硒酵母含硒蛋白的研究主要集中在硒代蛋氨酸（谢小雪等，2020）。Whanger（2002）研究酵母富集硒发现，酵母硒中硒代蛋氨酸含量为23%～63%，硒代胱氨酸含量为13%～21%，硒代甲基半胱氨酸含量为6%～20%。朱昌雄（2007）对酵母菌诱变后进行富硒研究，结果为诱变株细胞内硒代蛋氨酸含量为1650 μg/g。高愈希等（2013）采用反相离子对高效液相色谱－电感耦合等离子体质谱法测定富硒酵母中硒代蛋氨酸含量为921.04 μg/g，硒代半胱氨酸含量为15.41 μg/g。本试验通过HPLC-MS 联用法，测定不同时间添加不同浓度硒条件下酵母细胞硒蛋白含量，其中酵母培养6 h 后添加20 mg/L 硒，最终酵母细胞内硒代蛋氨酸含量为1044.57 μg/g，硒代胱氨酸含量108.33 μg/g，硒代甲基半胱氨酸含量72.2.1 μg/g。硒代蛋氨酸含量最高，这与其他学者研究结果一致，但是各氨基酸含量差异较大，可能的原因是菌种和培养环境不同。

4 结论

试验结果表明，加硒时间为6、8、10 h 和加硒浓度为10、15、20 mg/L 时，酵母生长较好。采用3，3'-二氨基联苯胺分光光度法测定酵母总硒和细胞内蛋白硒含量，表现出随加硒时间的增加，酵母生物量增加，总硒和蛋白硒含量降低，随加硒浓度的增加，酵母生物量降低，总硒和蛋白硒含量增加的规律。最佳加硒时间6 h，最佳浓度20 mg/L时，酵母总硒含量为1566.30 μg/g，细胞内蛋白硒含量为1336.82 μg/g。通过高效液相色谱串联质谱（HPLC-MS）法测定酵母细胞内硒代氨基酸含量进一步确定加硒浓度与硒代氨基酸的关系，随着加硒浓度的增加，硒代氨基酸含量随之增加，且均表现为硒代蛋氨酸含量最高，加硒浓度为20 mg/L 时，硒代蛋氨酸含量为1044.57 μg/g，硒代胱氨酸含量为108.33 μg/g，硒代甲基半胱氨酸含量为72.21 μg/g。