郝晓华，曹丽蓉，罗淑政，宿 婧

（忻州师范学院生物系，山西忻州 034300）

薄荷，唇形科多年草本植物，临床多用于风热感冒、温病初起、头痛目赤、咽喉肿痛等症。有利胆、镇静止痛、驱除害虫等功效。薄荷水提液有比较显著的抗氧化活性（李佩佩等，2014；郭晓恒等，2013；房海灵等，2010），对具有氧化性的自由基有较高的清除作用。多糖是一类由多个单糖通过糖苷键连接起来的大分子，广泛存在于动植物体内。多糖对许多微生物的生长和繁殖有可能造成生长拮抗，但其机制还不太清楚（张唐伟等，2011），多糖还有抗肿瘤（Sun 和Zhou，2012）、抗氧化（Fan等，2012）、抗病毒（Navid 等，2012）和免疫调节（Yi等，2012；Li 等，2012）等功效。近年来多糖的药理作用研究日益受到关注，但对于薄荷多糖的研究却鲜见报道。本试验用响应面优化超声波法提取薄荷多糖，以期为薄荷多糖的产品开发奠定理论基础，为薄荷的充分开发利用提供新思路。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 UV-2102C 型紫外可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司；HC-2062 高速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；KQ3200DV 型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

干薄荷，购买于忻州市五台山大药房；95%乙醇（含量≥95%），天津市申泰化学试剂有限公司；苯酚、葡萄糖、浓硫酸、水杨酸。以上药品及试剂均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 超声波法提取薄荷多糖 将干薄荷叶粉碎后过60 目筛。称取1.00 g 薄荷粉末于100 mL 小烧杯中，以一定的料液比加入蒸馏水充分混匀，70°C 水浴加热20 min 后，调节超声波清洗仪的各项参数（功率、时间、温度按照试验设计的数值设置），超声处理后离心（4200 r/min，15 min）、过滤，再将沉淀加入一定量的蒸馏水以相同的料液比和超声条件提取，离心、过滤后合并两次滤液，将滤液浓缩至10 mL，加入无水乙醇，冷藏放置（4 ℃）24 h，充分醇沉后离心（4200 r/min，15 min），将沉淀物置于干燥箱（50 ℃，60 min）烘干，得到多糖粗制品。

1.2.2 多糖标准曲线的制定 准确称取葡萄糖0.01 g，倒入蒸馏水不停搅拌，待溶解之后定容到100 mL 即为葡萄糖母液。准确取量0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 母液于刻度试管中，每管加入一定量的蒸馏水使其体积为1 mL，滴加浓硫酸5 mL 和5%苯酚溶液1 mL，充分振荡摇匀，待冷却至室温后测490 nm 下吸光度，绘制多糖浓度与吸光度标准曲线图（戴喜末等，2011；王桃云等，2011）。

1.2.3 薄荷多糖提取率的测定 按照如下公式计算薄荷多糖的提取率（张保等，2016）：

提取率/%=（CV/1000 m）×100%；

式中：C 为多糖的质量浓度，mg/mL；V 为样品溶液的总体积，mL；m 为薄荷粉末的质量，g。

1.2.4 单因素试验 称取1.00 g 薄荷粉末于烧杯中，以蒸馏水为提取剂，在料液比1∶10、1∶30、1∶50、1∶70、1∶90，超声时间20、25、30、35、40 min，超声温度20、30、40、50、60 ℃，超声功 率90、105、120、135、150 W 的条件下进行单因素试验，每组做三个重复，考察各因素对薄荷多糖提取率的影响程度。

1.2.5 响应面优化分析超声波法提取薄荷多糖最优条件 以单因素试验结果为依据，以提取薄荷多糖影响显著的三个因素以及每一个因素中提取率较高的三个参数设计三因素三水平响应面优化试验（表1）。

表1 薄荷多糖提取试验设计因素与水平

1.3 薄荷粗多糖抗氧化性研究

1.3.1 薄荷粗多糖清除DPPH 自由基能力的测定滴加0.005、0.015、0.025、0.035、0.045 mg/mL 多糖溶液1 mL 于各试管中，添加0.2 mmol/L DPPH·溶液3 mL，避光放置30 min 后测其在517 nm 的吸光度记作A1，取1 mL 薄荷多糖溶液加入3 mL 95%乙醇，避光放置30 min 后测其在517 nm 的吸光度记作A2，取1 mL 蒸馏水加入3 mL DPPH·溶液，避光放置30 min 后测其在517 nm 的吸光度记作A0，不同浓度的多糖溶液对DPPH 自由基的清除率公式为：清除率/%=A0-（A1-A2）/A0×100。将维生素C 作为标准品对照薄荷多糖的抗氧化性强弱（杨润亚等，2012；刘然等，2012；陈丽娇等，2012）。

1.3.2 薄荷粗多糖清除羟自由基能力的测定 滴加0.005、0.015、0.025、0.035、0.045 mg/mL 多糖溶液1 mL 于各试管中，加入6 mmol/L FeSO4溶液、6 mmol/L 乙醇水杨酸和6 mmol/L H2O2各1 mL，摇匀后5000 r/min 离心5 min，在510 nm 测其吸光度记作Ax，将多糖溶液换成1 mL 蒸馏水按上述方法测其吸光度记作Ax0，将H2O2换成1 mL 蒸馏水按上述方法测其吸光度记作Ax1，不同浓度的多糖溶液对羟自由基的清除率计算为：清除率/%=Ax0-（Ax-Ax1）/Ax0×100。将维生素C 作为标准品对照薄荷多糖的抗氧性强弱（许小向等，2015）。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线 葡萄糖标准曲线及回归方程见图1。各数值均采用Microsoft Excel 2010软件进行处理，得出葡萄糖标准曲线及回归方程：y=13.9248x+0.0064，并以该方程计算薄荷多糖的含量。

图1 葡萄糖标准曲线

2.2 薄荷多糖的提取单因素试验结果与分析

2.2.1 料液比对薄荷多糖提取率的影响 由图2可知，在150 W、50 ℃、20 min 的条件下，料液比1∶50 时多糖得率最高。溶剂增加后，多糖的浸出率也随之增加，当细胞内多糖浸出率达到最大值后，溶剂继续增加只会使提取率下降，所以选用1∶50作为薄荷多糖提取的最佳料液比。

图2 料液比与薄荷多糖提取率折线图

2.2.2 超声时间对薄荷多糖提取率的影响 由图3 可知，在50 ℃、150 W、1∶50 的条件下，随着提取时间的延长多糖提取率总体呈先升后降的趋势。超声波可破碎细胞，时间越长，细胞破碎越充分，多糖提取率上升。但超声时间过长可能使多糖结构破坏导致提取率下降。35 min 时，薄荷多糖的提取率最高，故选用35 min 作为薄荷多糖最佳超声时间。

图3 超声时间与薄荷多糖提取率折线图

2.2.3 超声温度对薄荷多糖提取率的影响 由图4 可知，在35 min、150 W、1∶50 的超声条件下，随着超声波提取温度升高，提取率先升高后降低。温度高时分子运动快，有利于多糖溶出，在40 ℃时薄荷多糖的提取率达到最高，所以选用40 ℃作为薄荷多糖的最适提取温度。

图4 超声温度与薄荷多糖提取率折线图

2.2.4 超声功率对薄荷多糖提取率的影响 由图5 可知，在1∶50、40 ℃、35 min 的条件下，随着超声功率的增大，提取率先升后降，可能是因为在相同时间及料液比的情况下，功率越大，细胞破碎越多，使多糖的提取率上升，但功率过大会使非糖物质大量浸出使多糖得率降低。本试验中超声功率为135 W 时薄荷多糖的提取率最高，选用135 W作为薄荷多糖的最佳提取功率。

图5 超声功率与薄荷多糖提率折线图

2.3 超声波法提取薄荷多糖工艺的响应面优化分析

2.3.1 响应面分析法试验设计与结果 将表1 内容输入Design—Expert8.0.5 软件中，得到薄荷多糖的提取率为响应值的17 组试验设计，得到的试验结果见表2。

表2 薄荷多糖提取工艺响应面分析试验设计及结果

2.3.2 二次项数学模型的可行性分析 由表3 可知P=0.0124＜0.05，说明该方程得到的工艺条件对实际操作影响显著，这个方程得到的条件可用于提高薄荷多糖提取率；失拟项P=0.4406＞0.05，说明方程得到的理论值和真实值相差不大，可以用于现实的生产操作中。综上所述，可使用该数学模型预测超声波法提取薄荷多糖的最优提取工艺以及在该条件下的最高提取率。本研究得到的二次项方程为：Y=1.55 +0.051A -0.017B +0.10C +0.075AB-0.072AC+0.085BC -0.091A2-0.044B2-0.19C2（A 超声功率、B 超声时间、C 料液比、Y 提取率）。

依据表3 可知各要素改变提取率的能力从小到大依次为：超声时间（F=0.35）＜超声功率（F=2.99）＜料液比（F=12.23），在三个要素中，料液比（C）对薄荷多糖提取率的影响非常显著（P ≤0.01），功率和时间（A、B）对提取率影响不显著（P＞0.05），各交互项（AB、AC、BC）对薄荷多糖提取率的影响也不显著（P ＞0.05），功率和时间的二次项（A2、B2）对薄荷多糖提取率的影响不显著（P ＞0.05），料液比的二次项（C2）对薄荷多糖提取率的影响非常显著（P ＜0.01）。

表3 方差分析表

2.3.3 交互项及等高线图、三维曲线图 响应曲面图中曲面的陡峭程度越大，对提取率的影响程度越大。等高线图可反映因素之间的交互作用，越偏圆形，表示交互不显著。越偏椭圆，表示交互显著。由图6（a）可知功率一侧的曲面比时间一侧陡峭，说明功率对提取率的影响更大；由图6（b）可以看出，等高线不够密集，呈椭圆形，结合方差分析表，可知超声功率和时间之间存在相互影响但是影响不大。由图7（a）可以看出，在料液比一侧的曲面比超声功率一侧更陡峭，故料液比对薄荷多糖提取率影响更大；由图7（b）可看出，等高线不够密集且接近圆形，说明超声功率和料液比之间相互影响较小；由图8（a）可看出在料液比一侧的曲面比时间一侧更陡峭，说明料液比对薄荷多糖提取率影响更大；由图8（b）可以看出，等高线密集且为椭圆形，料液比和超声时间之间有相互影响且影响较大。

图6 超声功率和时间的交互作用曲线图（a）和等高线图（b）

图7 超声功率和料液比的交互作用曲线图（a）和等高线图（b）

图8 超声时间与料液比的交互作用曲线图（a）和等高线图（b）

2.3.4 响应面分析优化薄荷多糖提取最优条件采用Design Expert8.0.5 分析数据，得出超声波法提取薄荷多糖的最优条件：功率134.39 W、时间30.09 min、料液比1∶55.80，提取率约为1.57%。在实际操作中，为了增加试验的可行性，可将预测的超声波法提取薄荷多糖最优工艺修改为：超声功率135 W、超声时间30 min、料液比为1∶56，在此条件下重复三次，提取率平均值为1.57%，高于单因素试验结果，证明响应面得到的方程是可靠的。

2.4 测定薄荷粗多糖的抗氧化性能力

2.4.1 薄荷粗多糖清除DPPH 自由基能力的测定结果 由图9 可知，随着维生素C 浓度的增大，其清除率增大，抗氧化性越强，样品和维生素C 的抗氧化性不断接近，最大清除率可达到维生素C 的86.3%，证明薄荷多糖具有较强的抗氧化性。

图9 薄荷粗多糖对DPPH 自由基的清除作用

2.4.2 薄荷粗多糖清除羟自由基能力的测定结果由图10 可知，随着样品（维生素C）浓度的增大，其对羟自由基的清除率增大，样品和维生素C 的清除率不断接近，当薄荷多糖浓度为0.045 mg/mL时，对羟自由基的清除率为71.50%，因此薄荷多糖对羟自由基具有明显的清除作用。

图10 薄荷粗多糖对羟自由基的清除作用

3 结论

本研究通过响应面法优化超声波提取薄荷多糖的提取条件，首先进行单因素试验，并依据试验结果采用薄荷多糖得率较高的因素和水平设计响应面优化试验。得出以下结论：超声时间、超声功率、料液比三个因素之间交互作用较小；响应面采用的三个因素对薄荷多糖提取率影响程度由小到大依次是：超声时间＜超声功率＜料液比；本研究最终得到薄荷多糖的最佳提取条件为：超声时间30 min、超声功率135 W、料液比1∶56，在此条件薄荷多糖的提取率为1.57%。得出最优工艺后，采用优化后的试验条件提取薄荷粗多糖，用于进行抗氧化试验。随着薄荷多糖浓度不断增大，抗氧化性增强。当浓度增加到一定值后其抗氧化性与维生素C相差无几，说明薄荷多糖具有较强的抗氧化性。