陈颖 综述 付炜 审校

【提要】为了降低药物开发的成本，以及对心脏特定疾病的发生发展进行准确的临床预测并制订个性化的治疗方案，需要开发相关的体外试验平台。这个平台既要具备高度精确性，能模拟复杂的心脏微环境，又要保证操作简易、经济成本低廉，心脏芯片应运而生。心脏芯片利用其精细的结构，精确模拟体内环境，大大提升了体外试验平台的可靠程度，成为未来心脏组织工程领域最重要的发展方向之一。本文将对心脏芯片的基本组成及优化进行阐述。

近年来，心血管疾病已经成为危害国民健康的头号杀手。在过去的半个世纪中，大约20%的药物因心脏毒性召回，并且在药物开发过程中，因药物诱导的心脏毒性导致药物开发损耗占了很大比例。由于缺乏有效的体外检测方法准确评估药物对心脏的毒性作用，以及动物实验成本高昂，因此需要开发相关的体外平台，使之既能再现心脏组织水平的功能，促进组织发育、器官生理学和疾病病因学的研究［1］，又能在药物开发中，研究分子作用机制、毒性测试和生物标志物鉴定［2］，廉价且可靠地测试候选药物。

体外研究的核心是组织器官的建模。理想情况下，体外模型应具备高精度以及与天然组织的相似性，可以模拟复杂和动态的体内环境，同时易于操作、成本低廉。传统体外研究是建立在组织培养皿上，在静态条件下进行单层的细胞培养。然而，通过标准的细胞培养方法很难再现心脏生理和病理学的复杂性。微流控心脏芯片可在单细胞水平、多细胞水平和3D 组织水平进行体外研究，从而解决了这一难题。

1 微流控心脏芯片

心脏芯片是利用微米大小的流体腔室，在连续灌注的条件下培养细胞，以模仿健康和患病心脏组织的生理学和病理生理学。其目标不是构建一个完整的活体心脏，而是合成再现心脏功能的最小单位。芯片技术将材料科学、细胞生物学、生理学和组织工程学的方法与微系统工程学和微流控技术相结合，利用微流控芯片系统对微流体、细胞及其微环境精确、灵活的操控能力，创造了一种活细胞的微生理环境。心脏芯片最简单的系统是含有一种细胞的单个灌注微流体室。在更复杂的设计中，可以由两个或多个微流体室培养不同的心脏细胞类型［3］。这些细胞从一个细胞腔室连接到另一个腔室，以模拟不同细胞之间的生理相互作用或研究体外药物分布。心脏芯片可以结合生理水平的理化刺激［4］，进行活细胞的生化、遗传和代谢活动分析。

2 心脏芯片的制作与材料进展

“芯片”的制造方法源于制造计算机微芯片的光蚀刻法的改进形式，微流体培养系统通常是通过“软光刻”制造的。心脏芯片可使用微成型、微蚀刻、激光蚀刻、注塑、光聚合、固体印刷和其他微制造方法。这些技术用于设计和制造具有高空间分辨率（最高达几微米），并且具有生物相容性和高度定制化的三维结构［5］。在组织工程技术较为成熟的环境下，芯片装置可实现精确的微图案化。这些装置可与微传感器集成［6］，用于分析生化因子、细胞迁移和流体压力等［7］。

2.1 硅／玻璃基底系统

芯片的结构设计首要问题是选取芯片材料。心脏芯片所利用的材料在近十年来已不断优化。最早的芯片是构建在硅片上的，由于硅电渗稳定性及生物兼容性不如石英玻璃，因此被取而代之。这些系统可以长期、多次使用，例如硼硅酸盐玻璃、铟锡氧化物玻璃等。此类系统具有不可渗透氧气的显著特性，因此常常结合常氧／缺氧条件［8］来模仿正常／病理学病症进行体外研究［9］。但是，由于这类系统成本高昂且制造过程复杂，因此并未得到广泛使用。

2.2 聚合物基底系统

高分子聚合物兼具硅／玻璃的系统优势，而且种类众多、可重复变形、价廉，更适合于批量生产、一次性使用，因此成为制作微芯片的理想材料。各种聚合物（如PDMS、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等）已被用作微型设备的生物相容性基材。在众多聚合物中，由于PDMS 对氧气的渗透性和成本效益较好，是最流行用于芯片制造的材料。一些天然来源的聚合物，如琼脂糖、纤维蛋白和胶原蛋白等，也被用于微流控细胞培养。Lee 等［10］利用聚对二甲苯层覆盖聚氨酯纤维，制成超软生物集成电子设备以监测动态的心肌细胞搏动情况。Lind 等［11］综合利用多种黏弹性油墨材料进行3D 印刷制作芯片，可集成各种功能、结构和生物材料，提高了模型的制作效率。Derda 等［12］提出了一种纸基微流体系统，该技术将多张薄片彼此堆叠以模仿3D 架构，后续可以进行逐层分子分析。Li 等［13］首次利用3D 微流控纸基分析装置实现了对3 个急性心肌梗死生物标志物的同时测定。

3 心脏芯片的细胞来源

从心脏分离出的心肌细胞用于研究心脏生理已有一个多世纪。然而，这些研究大多利用了无方向性生长的未成熟细胞，不能准确再现体内组织功能和药物反应。目前，用于芯片上心脏发育的材料来源主要是组织活检和原代细胞，也是研究心脏生理学的最佳体外模型。

3.1 动物源性心肌细胞

动物源性心肌细胞易于获取且可在培养物中维持更长的时间，因此在早期的研究中应用广泛。1963 年，首次分离出新生大鼠心室肌细胞（NRVM），这些可以自发跳动的细胞成为研究心血管生理的宝贵资源［14］。早期的研究经常从相对较大的动物中分离出成体心肌细胞，如猫、兔、犬和豚鼠等。与成体心肌细胞相比，新生动物心肌细胞相对容易分离，并且可以使用非病毒基因转移方法进行转染。由于心肌细胞是终末分化的，在培养中不会分裂，因此研究尝试获得永生化的心肌细胞系，如AT-1、HL-1、H9C2 细胞等，但是这些细胞系不能准确地再现心肌细胞的结构和生理功能。组织活检和原代细胞的表型在体外会随着时间而改变，因此并不是在微系统中建立模型的最佳选择［15］。

3.2 人源性心肌细胞

近来的研究转向在体外从多种细胞来源产生组织工程化的心肌组织，如使用人干细胞。干细胞具有分化成其他类型细胞的可能性以及自我更新和再生的能力，在适当的生长因子或理化刺激下可以分化成心肌细胞。

3.2.1 骨髓干细胞

骨髓干细胞又称骨髓单核细胞（Bone marrow mononuclear cell，BM-MNC），包括间充质干细胞、造血干细胞和内皮祖细胞。间充质干细胞经诱导可分化为心肌细胞。由于骨髓干细胞作为自体细胞来源具有易得性，因此成为心肌损伤相关研究的重要细胞来源［16］。

3.2.2 脂肪干细胞

脂肪干细胞（Adipose-derived stem cell，ASC）具有多向分化的潜能，由脂肪干细胞来源的心肌细胞可以观察到横纹肌的横纹、多核和跳动的细胞，这些都强烈提示脂肪源性干细胞能够分化为功能性的心肌细胞。Yamada 等［17］成功鉴定出棕色脂肪组织中的心脏祖细胞，棕色脂肪衍生干细胞（BADSC）提供了一种新的心肌细胞来源［18］。

3.2.3 胚胎干细胞

胚胎干细胞（Embryonic stem cell，ESC）来源于早期囊胚的多能性内细胞团，可以修复受损的染色体端粒末端，从而实现无限的细胞增殖。研究发现，通过抑制Wnt／β-catenin 信号转导通路可以促进ESCs 向心肌细胞分化［19］。但是，取材困难和伦理问题限制了ESC 在心脏研究领域的进展。

3.2.4 诱导多能干细胞

诱导多能干细胞（Induced pluripotent stem cell，iPSC）由体细胞重编程形成，来源广泛，避开了伦理问题和免疫排斥问题。面对临床个体差异的挑战，iPSC 以个体匹配的方式为药物开发进程和治疗效果带来了突破和进展，使其成为构建人类心脏模型的绝佳来源［20］。Zhang 等［21］利用人iPSC来源的心肌细胞（iPSC -CMs）构建内皮化的心肌。Kolanowski 等［22］通过优化微流体系统，利用血流动力来增强iPSC-CMs 的成熟。当前干细胞培养的分化效率低，需要使用大量试剂，芯片技术的应用可以有望解决这些问题［23］。

4 心脏芯片的构建条件及优化

在体内，细胞与邻近细胞／细胞外基质（ECM）相互作用，形成复杂的3D 结构，使心脏组织成为协调的整体，在动态环境刺激（例如，电脉冲、机械收缩、氧气变化等）下维持或破坏组织的稳态。心脏芯片可以在严格控制的生化和生理条件下维持心肌组织活性，模拟人类心脏的生物特性。

4.1 电刺激

体内心肌细胞不断受到电信号的作用以促进同步收缩。电刺激可用于改善心肌细胞的结构和功能［24］以及同步跳动组织的形成。电场与心脏芯片的集成系统还可以精确控制细胞行为、细胞迁移，并将干细胞分化为心脏细胞类型。电极材料对细胞的自发跳动具有强烈的影响，可以使用各种类型的电极进行细胞的电刺激，如不锈钢棒、聚碳酸酯导线、炭棒、铂电极、氧化铟锡薄膜等。Cheah 等［25］通过铂丝电极对心脏组织进行电刺激，证明电刺激可使心脏组织存活时间延长。还有一些电气系统通过集成的微电极阵列（MEA）进行场电位的细胞外记录，对细胞功能进行非侵入性和多部位监测［26］。另外，还可以将导电材料与PDMS 混合，并从专用通道注入导电混合物，从而将电极嵌入芯片［27］。

4.2 机械刺激

4.2.1 机械循环应变

心肌细胞在体内受到有节奏的心脏跳动诱导的周期性机械应变。在芯片内，可以利用循环拉伸模拟细胞在生理条件下所处的环境信号，以促进体外组织成熟。通过载有诱导循环应变的气动致动系统，心脏芯片能促进受刺激的细胞发生心脏分化，以及表现出电和机械耦合［28］。Rogers 等［29］报道了一种心脏芯片，在病理血流动力学负荷下诱导细胞形态和基因表达的改变，模拟肥厚性和扩张性心肌病。Nguyen等［30］提出了类似的模型模拟了左心室的工作周期，机械刺激的细胞相较于未受机械刺激的细胞表现出更强的F-肌动蛋白定向排列与更高的α-肌动蛋白表达和增殖率。

4.2.2 剪切应力

在微流控系统中运输营养、废物、细胞因子或其他化学物质时，流体会在其内部培养的细胞上产生剪切应力。细胞上的剪切应力大小取决于所施加的液体流速和微通道几何形状［7］。剪切应力已成功用于将干细胞分化为心肌细胞［31］、内皮细胞、血管平滑肌细胞等。Figallo 等［32］提出了一种用PDMS 制造的微型设备，该系统能降低细胞所受的流体压力并使之具有较高的剪切应力。在剪切应力作用下的人类胚胎干细胞表现出较高水平的血管分化。

4.2.3 表面／结构刺激

表面／结构刺激也称为被动机械刺激。由于基质的结构尺寸、机械特性、孔隙率和形态不同，在ECM 上培养的细胞会受生物力学信号的影响。ECM 的结构和成分会直接或间接影响细胞形态、黏附、方向、迁移和细胞膜的变形。ECM刚度的变化会影响心肌细胞的成熟和收缩力。Wang 等［33］发现，新生大鼠心室肌细胞在具有深沟槽的软基底上的收缩效果更好。Battista 等［34］提出了材料组成和结构在促进ESCs 分化中的作用。纤连蛋白可优先刺激血管生成，而层黏连蛋白的诱导可将细胞分化为跳动的心肌。

4.3 基质支持

用于支持3D 培养的基质（也称为支架）在确保更好的生长、分化和细胞间信号传导中起着关键作用。芯片技术已将基于凝胶和无凝胶的基质用于生物学领域的各种应用。

4.3.1 凝胶系统

结合水凝胶构建的支架能支持气体的运输和必需的养分交换来促进细胞的正常发育，并且能适应剪切应力的变化［35］。目前，支持支架构建的水凝胶有胶原蛋白、纤维蛋白、透明质酸、基质胶、纤连蛋白、琼脂糖、聚（乙二醇）二丙烯酸酯或上述物质的混合物等。透明质酸和胶原蛋白等已被用于促进内皮细胞的生长［36］，可用于研究VEGF 对内皮细胞的增殖和迁移的影响。水凝胶能够对孔径、纤维厚度、浓度梯度进行调整［37］，利用微流体技术能够生产不同形状和尺寸的支架，进一步模拟体内微环境和结构的改变。

4.3.2 无凝胶系统

将细胞嵌入水凝胶操作复杂，而且水凝胶的组成和性质通常会发生变化，从而限制营养物质和氧气通过厚而致密的水凝胶进行传输，导致细胞活力降低。其次，基于凝胶的芯片系统不适合建立细胞密度大或无细胞外基质的组织结构，因此可以通过无凝胶培养系统来解决这些问题。例如，利用聚合物修饰细胞，促进胞间连接，从而导致细胞聚集而无需使用水凝胶基质［38］。

4.3.3 生化刺激

将生化因子以可溶性因子的形式或作为细胞外基质的一部分引入细胞培养中，可促进细胞分化。例如，使用BMP-4、Activin-4、bFGF、Activin-A、VGEF 和DKK-1 的混合物来诱导细胞分化成心肌细胞［39-40］。目前有研究将生化因子与微流控系统相结合，促进细胞的分化，如分化成肌细胞、成骨细胞等。肾上腺素能受体（AR）激动剂、三碘甲状腺素（T3）、胰岛素样生长因子Ⅰ（IGF-Ⅰ）、miRNA 等也被用于促进心肌细胞的成熟。

5 展望

心脏芯片的发展需要克服许多挑战。首先要解决的问题就是制造材料的选择。大多数芯片都由PDMS 制成的，PDMS 有很多优势，但同样存在缺陷。PDMS 会吸收小的有机化合物，包括许多药物，且其高透气性会阻碍某些应用。最近，发现一些其他聚合物，如基于柠檬酸的可生物降解聚酯［41］，具有PDMS 的优点，但不会吸收小的疏水性药物。然而，需要更多的研究来确定可用于以低成本大量生产心脏芯片的合适材料。其次，PDMS 膜可能具有与天然基底膜不同的运输、机械和结构特性。另一个主要挑战是技术稳定性，必须协调各种因素，实现心脏芯片的最佳功能，包括细胞接种、ECM 涂层、流体控制、保持浓度梯度、去除芯片制作中产生的气泡等。尽管最近有一些成果表明心脏芯片可以模仿特定的器官级功能，但该领域仍处于起步阶段。如该技术可改进到能有效表现心脏对化学物质、药物和毒素的反应程度，那么将为药物发现、毒理学和个性化医学开辟新的途径。