段登文，许 彬，孟 静

（云南农业大学园林园艺学院，云南 昆明 650201）

食用玫瑰为蔷薇科蔷薇属植物，不仅具有较高的观赏价值，而且具有药用价值和经济价值，同时也是世界驰名的香料、配料。我国食用玫瑰种植具有悠久的历史，山东平阴、甘肃苦水、新疆和田、贵州安顺、云南八街等地均种植不同品种的食用玫瑰[1]。随着研究的扩展和深入，食用玫瑰品种越来越多，且以其为原料的产品也层出不穷，逐渐成为一种消费新时尚。其中，较为常见的油食兼用品种有平阴1号、四季玫瑰、大马士革等[2]；而金边、墨红、滇红等具有生长势强、抗病虫害中等、产量高的优点，并且花瓣可食用，也可用于加工薰茶、制酱、酿酒等[3]。

染色体特征对研究植物系统演化、亲缘关系、物种起源、进化与分类及杂种染色体鉴定具有重要意义。蔷薇属植物染色体基数为7[4-5]，且染色体倍性复杂多样，从二倍体到八倍体不等，有些还存在混倍体[6]，复杂多样的染色体组型虽然为品种选育提供了丰富的种质资源，但是也出现了因杂交不亲和而导致育种周期长等问题。因此，为了更好地利用种质资源，更有效地培育食用玫瑰新品种，研究种质资源染色体核型等细胞学特征尤为必要[7-9]。

基因组大小或称C 值，是指一个物种的配子体细胞核中染色体未进行复制时的DNA 含量。C 值是一个很重要的植物学特征，是植物学家进行种群进化、物种分类和生态学研究的有效依据[10]。迄今为止，测定基因组大小的方法主要有3 种：孚耳根微显影、基因组测序法以及流式细胞术（FCM）[11]。其中，流式细胞术具有高效率、准确度高、样品制备方便、分析快等特点，是测定植物基因组大小的首选方法。以往报道中，吴钰滢等[12]、李诗琦等[13]和丁晓六等[14]利用流式细胞术成功测定出部分蔷薇属植物的基因组大小，并推测其倍性水平。

目前，国内外关于食用玫瑰的研究较多，主要集中于栽培技术[15-16]、色素[17-18]、玫瑰精油及有机成分[19-21]等方面，而关于染色体核型分析及基因组大小的文献较少[22-25]。该研究采用常规压片法对6 种食用玫瑰品种进行染色体压片，观察其染色体形态，进行核型分析，并采用流式细胞术测定核DNA 含量与基因组大小，为食用玫瑰引种、培育和改良工作以及开发新品种提供参考与理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为平阴1 号、四季玫瑰、金边、墨红、大马士革和滇红这6 种食用玫瑰品种，均种植于云南农业大学苗圃内。

1.2 试验方法

1.2.1 染色体制片上午8：00—10：00，取无病虫害的顶芽2～5 mm，轻轻刮除外表皮及绒毛，在蒸馏水中用刀片切至薄片，置于浓度为0.002 mol/L 的8-羟基喹啉溶液中，放入0～4℃的冰箱中预处理2～3 h，蒸馏水清洗4～5 次后用配制的卡诺固定液（V无水乙醇∶V冰醋酸= 3 ∶1）固定8～24 h，再次洗净，放入5 mol/L HCl 中常温解离10 min。漂洗后放置于载玻片中央，滴加1 滴改良的苯酚品红染液染色2 h，吸去多余染色液，用带橡皮擦的铅笔轻敲盖玻片，使细胞分散均匀，将压片放于60℃烘箱处理5～8 min，以减少水分对观察的影响。将处理过的压片放在低倍光学显微镜下，选取分散较好的区域，调至100 倍镜下选取30个分散良好、染色体形态清晰的分裂中期细胞进行拍照及分析。

1.2.2 流式细胞术取样品嫩叶约1 g，蒸馏水洗净表面的尘土，滤纸吸干后放入预冷的培养皿中，将样品置于0.8 mL 预冷的mGb 解离液，用锋利的刀片将组织迅速垂直切碎，使其在解离液中冰上静置10 min，然后用400 目滤网过滤，得到细胞核悬浮液。采用适当体积且浓度均为50 μg/mL 预冷的碘化丙啶和RNAase 溶液，置于冰上避光染色0.5～1.0 h。将染色后的细胞核悬浮液样品上 BD FACSCalibur 流式细胞仪检测，采用488 nm 蓝光激发，检测碘化丙啶的发射光荧光强度，每次检测收集10 000 个颗粒，每个待测样品设2 个重复，变异系数CV（%）控制在5%以内，使用Modifit 3.0 分析软件作图分析。以已明确的日本晴水稻及番茄为内参，将待测样品的荧光信号强度与其对比，判断倍性并通过进一步计算得到基因组大小。

1.3 数据分析

选取良好分散的染色体用LAS EZ 软件在Leica DM500 显微镜下捕获图像，利用Photoshop CS 6 进行图片处理及配对，采用ImageJ1.80 进行染色体长短臂的测量，采用Excel 2010 软件进行数据处理，分析染色体核型并建立染色体核型模式图。使用ModiFit 3.0软件分析得到流式细胞仪分析图。按照李懋学等[26]提出的核型分析标准以及Levan 等[27]的两点四区命名系统对染色体形态划分归类，染色体核型分类按Stebbins[28]的方法来进行，染色体核型不对称系数按Arano[29]的方法计算。

2 结果与分析

2.1 染色体数目及核型分析

从图1、图2 可以看出，6 种食用玫瑰品种染色体基数x= 7。其中平阴1 号和四季玫瑰为二倍体，染色体数目均为2n= 2x= 14；金边和墨红是三倍体，染色体数目均为2n= 3x= 21；大马士革和滇红是四倍体，染色体数目均为2n= 4x= 28。进一步对染色体形态测量计算，得到染色体核型参数（表1）。6 种试材的染色体均靠中部和近中部着丝点区，未发现随体染色体，基本由m、sm 组成。核型不对称系数范围在55.19%～60.00%之间。其中，平阴1 号核型公式为2n=14 = 12m+2sm，核型不对称系数为60%，1A 核型；四季玫瑰核型公式为2n= 2x= 12m+2sm，核型不对称系数为57.00%，1B 核型；金边核型公式为2n=3x= 21m，核型不对称系数为55.19%，1B 核型；墨红核型公式为2n= 3x= 17m+4sm，核型不对称系数为57.30%，2C 核型；大马士革核型公式为2n= 4x=26m+2sm，核型不对称系数为56.07%，1B 核型；滇红核型公式为2n=4x=24m+4sm，核型不对称系数为56.68%，2B 核型。

图1 6 种食用玫瑰品种部分镜检图。

图2 6 种食用玫瑰品种核型模式图

2.2 6 种食用玫瑰核DNA 含量与基因组大小

对6 种食用玫瑰品种核DNA 含量以及基因组大小进行检测，结果如图3 所示，变异系数（CV）控制在5%以内。由表2 可知，6 种食用玫瑰试材的2C值变化范围为0.91～2.18 pg，1C 值变化范围为0.45～0.73 pg，2C 值最小的为二倍体种平阴1 号，基因组大小为（444.07±16.12）Mbp，最大的是四倍体种墨红，基因组大小为（1 066.75±2.97）Mbp。

表2 6 种食用玫瑰品种核DNA 含量和基因组大小

图3 6 种食用玫瑰品种流式细胞分析图。

表 1 6 种食用玫瑰品种染色体参数

3 结论与讨论

染色体数目及特征是重要的生物学数据，同一物种或品种的染色体数目恒定，对于阐述植物进化程度和相近种亲缘关系具有重要意义[30-31]，研究染色体数目可以为食用玫瑰远缘杂交亲本的选择提供依据，在种质创新方面也具有一定的参考价值。该研究分析了平阴1 号、四季玫瑰、金边、墨红、大马士革、滇红6 种食用玫瑰品种的倍性、核型分析参数、核DNA含量以及基因组大小。结果表明，6 种食用玫瑰品种染色体基数均为7，且未发现随体染色体，这与前人研究结果一致[32]。四季玫瑰染色体核型为二倍体、1B 核型，与招雪晴[22]和马雪[33]的研究结果一致；大马士革为四倍体，与蹇洪英等[24]和Jian 等[25]的研究结果一致，但Roberts 等[34]的研究显示该品种为三倍体，导致这种差异的原因可能是供试材料本身存在差异；其余4 种试材之前未见报道。依据Stebbins[28]的研究，在植物界中，高等植物染色体核型进化的基本走向是从对称向不对称发展的，在系统演化上具有相对对称核型的植物比较古老或原始，而常见衍生或进化比较高级的植物具有不对称核型。研究结果显示，6 种食用玫瑰品种染色体核型不对称系数由高到低依次为平阴1 号（60%）＞墨红（57.3%）＞四季玫瑰（57%）＞滇红（56.68%）＞大马士革（56.07%）＞金边（55.19%），由此可知，金边比较原始，平阴1号进化比较先进。

对蔷薇属核DNA 含量、C 值和倍性水平进行大规模的估计，不但能为野生物种的分类和系统研究提供核学信息，而且还可为蔷薇属植物资源的育种和遗传改良利用提供核学信息。对Jian 等[25]、Roberts 等[34]和Yokoya 等[35]关于蔷薇属1C 值的数据进行整理，发现二倍体种1C 值范围为0.37～0.89 pg，三倍体种为0.51～0.76 pg，四倍体种为0.46～0.68 pg，该研究的6种食用玫瑰试材均处于上述范围内。平阴1 号与四季玫瑰都是利用杂交手段培育而成的玫瑰品种，其中平阴1 号母本为单瓣红玫瑰（R. rugosa），父本为重瓣红玫瑰（R.rugosa‘Plena’）[36]；四季玫瑰母本为山刺玫（R.davuricaPall），父本为重瓣红玫瑰[37]。虽然关于上述2 个品种的基因组大小还未有报道，但前人研究显示玫瑰的1C 值为0.57 pg[34]和（0.58±0.07）pg[25]，与该研究中平阴1 号[（0.45±0.02）pg]和四季玫瑰（0.51 pg）的数值相比偏高，导致这种偏差的原因可能是2个食用玫瑰品种杂交亲本基因组偏小，也可能是供试材料之间的差异。Roberts 等[34]曾报道了大马士革的1C 值为0.59 pg，高于该研究中大马士革的1C 值（0.51 pg），推测产生偏差的原因可能是供试材料本身存在差异，也可能是因为地理条件和倍性水平不同而发生了杂交，导致其自身遗传信息存在个体差异。

食用玫瑰营养丰富、用途广泛，具有很高的开发价值和广阔的应用前景。国外食用玫瑰产业发展较好的有保加利亚、土耳其、印度和法国等，但随着我国经济的快速增长，人民生活水平的不断提高，我国已成为仅次于欧盟的第二大玫瑰消费地区，食用玫瑰的地位和作用也日趋拓宽，渗透到社会生活的多个领域[38]。该研究采用常规压片法，对6 种食用玫瑰品种染色体数目进行观察与核型分析，在一定程度上为食用玫瑰品种的倍性与核型研究提供了参考，为后续食用玫瑰品种的种质资源鉴定、系统演化研究及多样性改良提供了基础。此外，该研究利用流式细胞术快速测定了6 种试材的基因组大小，为后续AFLP 引物中选择性碱基个数的确定提供了依据，同时丰富了蔷薇属植物的C 值库，并为蔷薇属其他物种基因组大小测定方法提供了借鉴。