何晨晨，刘俐君，鲁晓燕

(石河子大学农学院/特色果蔬栽培生理与种质资源利用兵团重点实验室，新疆石河子 832000)

0 引 言

【研究意义】盐胁迫是植物生长发育过程中的重要限制因子，MicroRNA(miRNA)在植物应答非生物胁迫的过程中具有重要的调控作用。miRNA是位于基因组非编码区的内源性的小分子单链RNA，长度多为20～24 bp[1]，可特异识别靶mRNA并与之结合，降解靶mRNA、抑制翻译、甲基化，负向调控基因表达[2]，miRNA可以在转录水平、转录后水平和翻译水平参与植物体内的不同生物学过程[3]，植物的生长发育、信号转导以及对胁迫的应答等[4]。在植物抵御盐胁迫过程中，miRNA在调控植物种子萌发、花芽分化、形态建成等发挥重要作用[5]。新疆野苹果(Malussieversii(Ledeb.)Rome.)属蔷薇科(Rosaceae)，苹果属(MalusMill.)植物[6]，新疆野苹果主要分布在中亚地区的天山山脉，以及我国新疆西部伊犁和塔城地区，具有很强的生态适应性[7]；新疆野苹果作为我国西部地区的苹果生产的一个重要砧木，能耐极端最低温-30℃左右，对温度上限不敏感，耐旱力较强，耐瘠薄以及抗病虫害等多种优良的抗逆性状[8]。尹蓉[9]研究表明，对15种主要苹果属植物的抗逆性相关生长指标及抗逆系数分析表明，新疆野苹果属耐盐性中等苹果属植物资源。于玮玮等[10]研究表明，新疆野苹果幼苗在NaCl胁迫下可通过积累脯氨酸和可溶性糖，提高SOD和POD的活性，以减缓NaCl胁迫对幼苗造成的伤害且具有一定的耐盐性。【前人研究进展】Xu等[11]利用Illumina测序法对红肉甜橙研究显示，51个已知的miRNAs在突变型(MT)和野生型(WT)之间有显著的表达差异。Pantaleo等[12]在葡萄中鉴定出24个保守的miRNA家族，26个已知但不保守的miRNA。王永江等[13]对甜橙miRNAs进行了鉴定，预测并筛选出其调控的靶基因与植物与病原物互作相关。Niu等[14]研究发现，梨树与休眠相关的MADS-box基因和miRNAs共同控制着梨花芽休眠的转变。Sun等[15]研究表明，柑橘miRNAs及其靶基因与植物的发育、转录、蛋白质降解等多种细胞过程有关。【本研究切入点】吕新民等[16]预测miRNA及其靶基因与酸枣生长发育、转录调节等相关，其中一些基因可能参与酸枣响应NaCl胁迫过程。研究借助先进的Illumina测序平台对新疆野苹果NaCl胁迫应答的Small RNA进行测序，快速、高效地读取高质量的测序数据。【拟解决的关键问题】对150 mmol/L NaCl处理6和48 h时的新疆野苹果幼苗叶片进行small RNA测序。筛选差异表达的miRNA及其靶基因，为分析新疆野苹果的耐盐机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试材料为新疆野苹果种子，购买于新疆伊犁哈萨克自治州霍城县61团。

新疆野苹果种子经4℃低温层积处理90 d左右。发芽后播于进口泥炭∶蛭石=3∶1混匀的基质中，放置于人工气候箱(RXZ智能型，宁波江南仪器厂)中培养，培养条件为：温度(25±1)℃，相对湿度65%～80%，光照强度12 000 lx，发芽期黑暗状态，出苗期光照白天16 h，黑夜8 h。等种子发芽长出6～8片真叶时选取生长健壮的幼苗作为试材，剪取约2～3 cm的茎端幼嫩组织接入培养基中进行诱导分化培养，诱导培养基为：MS培养基+0.5 mg/L IBA+2 mg/L 6-BA；继代增殖培养基为：MS培养基+0.5 mg/L IBA+2 mg/L 6-BA，每30 d继代1次；连续几代增殖培养后选取生长健壮的茎段，接入生根培养基中培养，生根培养基为：1/2MS培养基+0.5 mg/L IBA；所有培养基中均加蔗糖30 g/L、琼脂粉7 g/L，用1 mol/L的NaOH调节pH值到5.8～6.0。组培苗生根后挑选根系生长较好，长势健壮且整齐一致的幼苗转入有1/2日本园式营养液水培盒中，培养1周后转入完全营养液中。将水培盒放入人工气候箱内进行培养，在培养箱外的一侧放置供氧泵，持续通氧。

1.2 方 法

1.2.1 试验设计

水培苗第6～8片叶完全展开时，处理：(1)对照(CK)，日本园式营养液；(2)NaCl处理，日本园式营养液加150 mmol/L NaCl。NaCl浓度以每天50 mmol/L的梯度逐步递增，全部处理于同1 d达到目标浓度，设此时为NaCl处理0 h。分别于处理6和48 h取新疆野苹果幼苗叶片，样品用清水冲洗表面杂物，再用去离子水冲洗干净，用吸水纸吸干表面水分，称取0.1 g，装入1.5～2 mL的冻存管中，对照的叶记作LCK6h、LCK48h；NaCl处理的叶记作LNa6h、LNa48h，迅速投入液氮中冷冻，于-80℃冰箱保存备用。每个处理重复3次。

1.2.2 新疆野苹果sRNA文库构建

提取样品的总RNA，small RNA测序由南京派森诺基因科技有限公司完成，质检合格后进行文库构建。将TotalRNA使用PAGE电泳切胶分离成18～30 nt的RNA，利用Blast将去接头、去低质量、去污染的Clean Reads与Rfam13数据库比对，统计分析数据库中小RNA的种类、数量和类型，并对其注释。

1.2.3 NaCl胁迫下miRNAs差异表达及靶基因GO和KEGG显著性富集

对新疆野苹果叶片差异表达的靶基因按照分子功能(MolecularFunction)、生物过程(Biological Process)和细胞组分(CellularComponent)进行GO分类，挑选每个GO分类中挑选p-value最小即富集最显著的前10个GOterm条目进行展示。

采用DESeq(version1.18.0，Anders S和Huber W，2010)分析4个处理中表达差异miRNA，按照表达量倍数差异|foldchange|>2和表达差异显著性p-value<0.05筛选出差异的保守miRNA。miRNA主要通过互补配对结合到靶位点。以该物种的mRNA的3‘UTR’序列为目标序列，对差异表达的miRNA序列，使用psRobot_tar进行靶基因预测，并对靶基因进行GO和KEGG显著性富集分析。

1.2.4 NaCl胁迫下新疆野苹果叶片差异miRNA与mRNA的反转录和实时荧光定量PCR

miRNA反转录采用miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA kit试剂盒(TIANGE，北京)合成cDNA，qRT-PCR使用miRcute Plus miRNA qPCR Kit试剂盒(TIANGE，北京)，采用20 μL反应体系：cDNA模板2 μL，2×miRcute Plus miRNA PreMix 10 μL，上下游引物(10-M)各0.4l，超纯水7.2l。qRT-PCR在CFX96 Real-Time PCR仪(Bio-Rad，美国)上进行，反应程序为：95℃预变性15 min，94℃ 20 s，60℃ 34 s，45个循环。

mRNA反转录采用5X All-In-One RT MasterMix试剂盒(abm，加拿大)合成cDNA，qRT-PCR使用Green Real time PCR Master MIX试剂盒(TOYOBO，日本)，采用20 μL反应体系：cDNA模板2 μL，2×SYBR Green Mix 10 μL，上下游引物(10 μM)各0.5 μL，超纯水7 μL。qRT-PCR在CFX96 Real-Time PCR仪(Bio-Rad，美国)上进行，反应程序为：95℃预变性1 min，95℃ 10 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，40个循环。利用Primer 6软件设计qRT-PCR引物，设计好的引物由生物工程(上海)股份有限公司合成。miRNA内参基因为5srRNA[17],mRNA内参基因为UBQ[18]。基因的表达量采用相对定量的方法，即2-△△CT法[19]。表1

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 The sequences of the primers for qRT-PCR

2 结果与分析

2.1 新疆野苹果叶片不同处理RNA质量检测

研究表明，每个样品的RNA完整值(RNA integrity number，RIN)均大于7.5，OD260/280均大于2.0，OD260/230均大于1.6，28S/18S均大于1.5，符合建库标准。表2

表2 不同处理RNA质量检测Table 2 Quality detection of RNA in different treatments

2.2 新疆野苹果叶片不同处理small RNA分类注释

研究表明，测序分别从LCK6h、LCK48h、LNa6h、LNa48h 4个文库中获得35 350 971、34 458 835、43 963 615、35 699 217条Raw Reads，去除污染序列，去除没有插入片段的reads，去掉包含polyA的序列和小于18 nt的小片段，分别得到29 610 812、28 904 431、41 122 379、33 401 117条Clean Reads，主要包含rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、known miRNA、novelmiRNA、以及unknown片段等。新疆野苹果叶片LCK6h、LCK48h、LNa6h、LNa48h 4个处理中Unique Known miRNA数量分别为6 331、5 561、5 825、6 074，Unique Novel miRNA数量分别为35、35、37、42。表3

表3 新疆野苹果数据过滤及small RNA分类注释Table 3 Data filtering and small RNA classification annotation statistics of Malus sieversii

2.3 新疆野苹果Clean Reads长度分布

研究表明，在LCK6h、LCK48h、LNa6h、LNa48h 4个处理中Total Reads的长度主要分布在20～24 nt，长度为24 nt的序列所占比例最多，其次是长度为21和20 nt的序列。Unique Reads的长度分布最多的均为24 nt。图1

2.4 NaCl胁迫下差异miRNA及靶基因预测

研究表明，在新疆野苹果已知的miRNA中，与对照相比，NaCl处理6 h时的差异miRNA数量为3个，其中上调表达的为2个，下调表达的为1个，靶基因数目为64个。NaCl处理48 h时的差异miRNA数量最多为13个，其中上调表达的为4个，下调表达的为9个，靶基因数目为108个。与NaCl处理6 h相比，NaCl处理48 h时差异miRNA数量为5个，其中上调表达的为3个，下调表达的为2个，靶基因数目为39个。NaCl处理6 h和48 h共有的差异miRNA有2个。表4

2.5 NaCl胁迫下miRNA靶基因GO显著性富集

研究表明，NaCl处理6 h时，GO主要富集的分子功能MF主要包括：肌醇磷酸2激酶活性、寡糖基转移酶活性、寡糖基转移酶活性等。细胞组分CC主要包括：网格蛋白复合物、网格蛋白包被的坑等。生物过程BP主要包括：蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶抑制剂活性、木聚糖代谢过程等。NaCl处理48 h时，GO主要富集的分子功能MF主要包括：氧氧化还原酶活性、DNA结合等。细胞组分CC主要包括：质外体、胞外区等。生物过程BP主要包括：木质素代谢过程、苯丙烷分解代谢过程、次生代谢过程等。图2

注：横轴为不同的序列长度，纵轴为对应长度的序列丰度(*10 000)。大图为去重前不同长度的Total Reads分布，右上角小图为去重后不同长度的Unique Reads分布Note:The horizontal axis is different sequence length,and the vertical axis is the sequence abundance of corresponding length(*10,000).Large image shows total reads of different lengths before deweighting Distribution:The small figure in the upper right corner shows the distribution of Unique Reads with different lengths after deduplication图1 新疆野苹果miRNA 长度分布Fig.1 Distribution of miRNA length in Malus sieversii

表4 NaCl胁迫下新疆野苹果差异表达miRNA及靶基因Table 4 differential expression of miRNA and target genes in Malus sieversii under NaCl stress

图2 新疆野苹果叶片miRNA的差异靶基因Go功能分类Fig.2 Go functional classification of differential target genes of miRNA in Malus sieversii

2.6 NaCl胁迫下miRNA的靶基因KEGG显著性富集

研究表明，NaCl处理6 h时，主要富集在N-glycan生物合成、N-磷脂酰肌醇信号系统、色氨酸代谢、苯丙氨酸代谢、光合生物中的碳固定等。NaCl处理48 h时，主要富集在N-glycan生物合成、其他聚糖降解、烟酸酯和烟酰胺代谢、丙酸酯代谢、真核生物的核糖体生物发生等通路。NaCl处理6和48 h时共同富集的是N-glycan生物合成通路。图3

图3 新疆野苹果叶片miRNA的靶基因KEGG通路注释Fig.3 KEGG pathway annotation of miRNA target gene in Malus sieversii

2.7 qRT-PCR验证差异表达的miRNA

研究表明，在新疆野苹果叶片差异显著的miRNA中选取6个miRNA和3个mRNA，mdm-miR168b、mdm-miR159c、mdm-miR827、mdm-miR390f及其靶基因HF10976、mdm-miR171i及其靶基因HF33844、mdm-miR399j及其靶基因HF11095。利用qRT-PCR检测基因的表达量，与测序数据趋势基本一致，且miRNA与其靶基因mRNA的表达量呈负相关。图4

图 4 qRT-PCR验证结果Fig.4 qRT-PCR validation data

3 讨 论

miRNA最早于发现线虫中[20]，大量miRNA在拟南芥[21]，玉米[22]，番茄[23]，水稻[24]等植物中也相继被研究发现。并且各类果树作物miRNA的研究也日趋成熟，已在苹果[25-26]、柑橘[27-28]、草莓[29]、葡萄[30-31]、桃[32]等果树中发现上百种不同的miRNA。Phillips研究表明，植物miRNA广泛参与生物胁迫和非生物胁迫等各类逆境胁迫的响应[33]，逆境胁迫会使得植物改变某些 miRNA 的表达模式，发生上调或下调表达，完成对其靶基因表达模式的调控[34]。

叶片中对照和NaCl处理的Clean reads长度主要分布在20～24 nt，长度为24 nt的序列所占比例最多，这与拟南芥[35]、番茄[36]、藏红花[37]等研究结果一样。对差异靶基因进行分类注释，NaCl处理6和48 h时，KEGG共同富集的通路有N-glycan生物合成，天冬酰胺连接的糖链(N-linked glycan,N-glycan)是内质网蛋白质量控制系统中一个重要的调节信号，刘传发[38]对拟南芥的分析发现，高尔基体糖原剪切酶突变体MNS1/2催化的N-glycan剪切的缺失调控了底物蛋白N-糖基化蛋白RSW2的丰度从而影响了纤维素的合成，产生了盐敏感的表型，MNS1/2介导的N-glycan的剪切可能调节底物蛋白对盐胁迫的响应。

冯克伟[39]对耐盐性野生二粒小麦研究表明，在150 mM盐胁迫下，7个miRNAs在3和6 h时表达量降低，12和24 h表达量显著上升，而在250 mM盐处理下miRNA在多个时间点均受盐胁迫抑制了表达。盐胁迫下山杨(Populustremula)miR398在3～4 h内其表达受到诱导，在48 h后开始下降，至72 h又开始积累[40]，Chen等[41]研究发现盐胁迫下拟南芥中miR159、miR171等表达上调，而miR398的表达下调。Liu等[42]在拟南芥中鉴定到在盐胁迫下miR396、mi R168和miR169等表达量升高，过表达miR397的拟南芥植株抗盐性提高。Patade等[43]发现甘蔗受到短暂的盐胁迫后miR159含量显著提高，miR159在甘蔗抗盐胁迫过程中发挥重要作用。Ding等[44]发现，玉米盐处理后mi R159大量增加。Wu等[45]发现盐胁迫下桑树(Morusalba)与对照相比miR827和miR2111的表达则显著下降。Sun等[46]研究大豆根尖分生组织发现miR390e、miR399a、参与了大豆根系耐盐性的调控。miR171是最早发现的 miRNAs 家族成员之一。Fan等[47]研究表明，水稻miR171通过剪切GRAS家族基因OsHAM促进营养生长向生殖生长过渡以及根尖分生组织稳态形成；拟南芥miR171通过靶向GRAS家族基因Scarecrow-Like(SCL)调控拟南芥的叶绿素生物合成[48]。Curaba等[49]发现大麦过表达的miR171能够激活miR156对其下游靶基因表达抑制，导致植物营养生长向生殖生长转变。实验通过microRNA测序及qRT-PCR验证发现，mdm-miR168b、mdm-miR159c、mdm-miR827、mdm-miR390f、mdm-miR171i、mdm-miR399j基因在NaCl处理6和48 h时表达量存在差异，其中mdm-miR390f及其靶基因HF10976、mdm-miR171i及其靶基因HF33844、mdm-miR399j及其靶基因HF11095表达量呈负相关，这3个miRNA参与了新疆野苹果对NaCl胁迫的响应过程，但是新疆野苹果不同时间点miRNA差异表达的调控原因及miRNA响应NaCl胁迫作用方式还需要进一步的试验验证。

4 结 论

NaCl处理6 h时3个miRNA差异表达，其中2个上调表达，1个下调表达，miRNA对应的靶基因数目为64个。NaCl处理48 h时13个miRNA差异表达，其中4个上调表达，9个下调表达，miRNA对应的靶基因数目为108个。mdm-miR390f及其靶基因HF10976、mdm-miR171i及其靶基因HF33844、mdm-miR399j及其靶基因HF11095表达量呈负相关，3个miRNA参与了新疆野苹果对NaCl胁迫的响应过程。