邓 斐，祁 贤，余慧燕，王慎骄，许 可，黄昊頔，鲍倡俊

0 引 言

甲型流感病毒属于正粘病毒科，能够感染人、禽和多种哺乳动物。血凝素(hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(neuraminidase，NA)是甲型流感病毒血清分型的靶标蛋白，目前已经在雁形目和鸻形目等野生水禽中发现了16种HA亚型和9种NA亚型，此外，在蝙蝠中发现了两种新的H17N10和H18N11亚型[1-4]。1966年首次在北美发现H9N2亚型禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)，目前已呈全球流行[5-6]。1994年在我国广东暴发疫病的家禽中分离到多株H9N2 AIV[7]，之后数年间该病毒传播到全国大部分地区，成为中国家禽中一个重要的禽流感病毒流行亚型[6-8]。

自1998年以来，不断报道人感染H9N2禽流感病毒的病例。目前，与H5Ny(y=1、6) 和H7Ny(y=2、3、7、9)一起，H9N2禽流感病毒成为危害动物和人类健康的重要病原体，对公共卫生的负面影响不容忽视[9-10]。本研究将对江苏省首例人感染H9N2禽流感病例进行分子溯源研究。

1 资料与方法

1.1 研究对象选取2019年3月18日江苏省疾病预防控制中心1份禽流感病毒感染患者(男，9岁)的咽拭子标本及从患者住处附近的农贸市场采集禽类和外环境样本共40份。采集患者咽拭子进行核酸检测和病毒分离。

1.2主要试剂和仪器流感病毒核酸分型检测试剂盒购于江苏硕士生物技术有限公司；QIAamp Viral RNA kit、QIAGEN购于公司；SuperScript© III First-Strand Synthesis System和 High Pure PCR Product Purification Kit购于 Invitrogen公司；Nextera XT DNA Sample Preparation Kit购于Illumina公司；Illumina MiSeq platform购于Illumina公司；荧光定量PCR仪VIIA7型购于ABI公司。

1.3流感病毒核酸分型检测采用荧光定量PCR法对标本进行流感病毒核酸分型检测，包括A型、B型、H1-H16、N1-N9。

1.4病毒分离和鉴定将患者咽拭子、环境和禽类标本接种9-11日龄的无特定病原体(specific pathogen-free，SPF)鸡胚，接种部分是尿囊腔，37 ℃条件下培养72 h。采用血凝试验测定病毒分离物的血凝特性，用0.9%等渗盐水配制1%鸡红细胞，病毒分离物进行2倍系列稀释，在V型血凝板上进行混合后，室温孵育20～30 min后观察结果。病毒分离在江苏省疾病控制中心生物安全三级实验室里完成。

1.5病毒基因组测序根据核酸提取试剂盒操作说明对病毒RNA进行提取。以病毒RNA为模板扩增cDNA，反转录引物采用通用引物U12(5′-AGCAAAAGCAGG-3′)[12]，反应体系采用单链合成试剂盒。测序文库的构建采用 Illumina公司的试剂盒。把800 μL测序文库混合样，加到测序平台的样品孔中，按照说明书完成基因测序，测序数据处理分析采用CLC Genomics workbench (CLC Bio)程序软件。

1.6进化分析在GeneBank和GISAID公网上通过BLASTn程序初步分析分离毒株的亚型和8个基因片段核苷酸最大相似的参考株。采用MAFFT软件进行核苷酸和氨基酸序列比对。进化树构建采用maximum likelihood 法(MEGA6.1，美国)。

2 结 果

2.1 荧光定量PCR检测结果流感病毒A型-M、H9-HA和N2-NA基因核酸阳性，而B型-M、H1-HA、H3-HA、H5-HA、H7-HA、N1-NA和N3 ～N9-NA基因核酸检测阴性，初步判定标本中的病毒为A型H9N2亚型流感病毒，见图1。从40份外环境样本中检出H9N2核酸阳性26份(65%)。

a:A型、B型、H9、H5、H7亚型检测；b:H9N2亚型检测

2.2病毒分离与鉴定患者标本和阳性环境标本接种SPF鸡胚，分离到1株人源病毒和8株环境来源病毒,活禽市场的鸡鸭标本中无病毒。9株病毒具有较高的血凝活性(HA价>1024)，核酸检测均为A型H9N2流感病毒阳性。

2.3基因组测序和进化树分析对1株人分离株和3份环境分离株进行全基因组测序，序列上传GASAID数据库，获得的序列号分别为：A/Jiangsu/1/2018(JS1) EPI1607417、EPI1607419、EPI1607422- EPI1607427；A/Environment/Taizhou/02/2019( EV/TZ02)EPI1607446- EPI1607453；A/Environment/Taizhou/03/2019(EV/TZ03)EPI1607454 -EPI1607461和A/Environment/Taizhou/10/2019 (EV/TZ10) EPI1607438- EPI1607445。序列比较结果显示，4株病毒基因组核苷酸序列相似度为99.8%～100%。4株H9N2流感病毒的6个基因片段(包括HA、NA、PB2、PB1、NP、NS)与近年来中国南方流行的H9N2病毒序列相似度最高(98%～99%)，而PA和M基因片段与H7N9病毒的相应基因同源性最高(99%)。以人分离株JS1为例，HA基因与参考株A/chicken/Shanghai/11/2018 (H9N2)核苷酸相似度最高(99%)，NA基因与参考株A/chicken/Shanghai/05/2018 (H9N2) 的序列相似度高达99%，其他6个内部基因(PB2、PB1、PA、NP、M和NS)与中国南方H9N2或H7N9病毒相应基因片段的核酸相似度高达98%～99%，见表1。

表1 A/Jiangsu/1/2018(H9N2) 8基因片段与NCBI和GISAID 流感数据库核苷酸相似度最大的参考株

HA基因进化树上， 4株病毒位于欧亚系Y280-like进化树上，属于Y280-like世系，见图1。与HA基因相似，NA基因进化树上,4株病毒的NA基因属于Y280世系，见图2。HA和NA进化树显示,人分离株和3株环境分离病毒同处于一个小的进化分支，遗传关系较近，表明它们有共同的起源。

图2 H9N2病毒HA基因进化树

图3 H9N2病毒NA基因进化树

2.4分离株的分子特征4株病毒HA蛋白除了228位氨基酸仍是G，其他4个位点都发生了突变，增强了病毒对人类SAα2-6Gal受体的结合力，见表2。NA蛋白274 (H→Y)位点未发生突变,表明病毒保留对神经氨酸酶抑制剂(如奥司他韦)的敏感性。此外，4株病毒的PB2蛋白E627位氨基酸没有突变，表明病毒对人体的适应力和致病力都有一定的局限性。

表2 4株H9N2病毒关键氨基酸位点分析

3 讨 论

自1990年代，H9N2已逐渐成为欧亚和北非地区许多国家家禽中流行的一种主要禽流感病毒亚型[6]。H9N2病毒可以感染多种家禽，发病率高但致死率较低，主要引起鸡的产蛋下降，严重制约养禽业的健康发展。此外，H9N2病毒为其他危害动物健康和公共卫生的禽流感病毒(包括H5N1、H5N6、H7N9等)提供内部基因，为不同亚型流感病毒的重配进化提供了丰富的基因池[15-17]。自1998年以来，已经报道了多起人感染H9N2禽流感病例[18-19]。血清学研究表明一般人群的抗体阳性率约1.3%，在职业人群中高达5%抗体阳性率[20-22]。本研究从患者附近农贸市场环境中检测和分离8株病毒，经基因序列分子进化分析，与患者体内病毒核苷酸高度同源，结合流行病学调查，初步判断这起事件是由禽流感病毒跨物种感染人所致，这也是江苏省首例人感染H9N2禽流感病例。

在禽流感跳跃种属差异感染人的过程中，HA蛋白的分子进化最受关注[22-23]。本研究中，感染人的H9N2人分离株和3株环境分离株的HA蛋白的裂解位点没有插入多个碱性氨基酸，表明病毒没有突变为高致病性禽流感病毒。HA针对两种不同唾液酸受体结合能力的改变是流感病毒跨种传播的关键，本研究中，4株H9N2分离病毒的HA蛋白受体结合部位有4个关键氨基酸位点(包括I155T, H183N,A190T/V和Q226L)发生突变，表明这些病毒对人类SAα2-6Gal受体的亲和力增加，跨种传播感染人的能力在增强，病毒未来的进化值得关注。

与人感染H5N1(病死率52.8%)、H5N6(65%)和H7N9(病死率39.2%)相比[9-10,25]，人感染H9N2病毒虽然症状较轻，病死率较低，但对人类健康和公共卫生造成重大威胁不容忽视。H9N2病毒在禽类中普通存在，地理分布范围广，虽然有禽用疫苗在应用，但病毒进化活跃，根除难度大[26-27]。在欧亚家禽中的3个H9亚型HA进化世系中，Y280-like是占优势的世系。研究表明，1994-2013年间，在中国家禽中发现了117种基因型，基因型多样性源于H9N2病毒内部基因重配异常活跃[27-28]。从2013年开始，G57基因型逐渐成为优势流行基因型。同时，G57基因型H9N2病毒为其他亚型流感病毒提供内部基因，包括H7N9、H5N6和H10N8等[29]。值得关注的是，H9N2病毒内部基因与其它流感病毒重配能力强，为人类未来流感大流行毒株的产生提供了可能的基因来源,特别是有与人类流感病毒H3N2和H1N1有发生重配的可能[30]。

综上所述，本研究发现人感染H9N2禽流感病例，进一步显示该病毒的重大公共卫生意义[31-32]，需要继续加强对禽流感病毒(包括H5、H9、H7和其它亚型)在人群、猪群、家禽、野禽和环境中生态监测，在流行病学和分子生物学水平密切关注病毒的演化，特别是跨种传播能力的改变。