刘 娟，马可忠，杨 峰，吴校林，卞 芳，龚 芳

0 引 言

心肌缺血再灌注损伤是多种心血管疾病的病理过程，如何减轻心肌缺血再灌注损伤一直是近年来的研究热点，研究表明中医药可以减缓缺血再灌注导致的心肌损伤[1-3]。桑白皮是桑科植物MorusalbaL.的干燥根皮，桑白皮多糖是其主要活性成分之一，具有抗氧化的作用[4]。研究报道桑白皮多糖能显著升高小鼠血清中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性，降低血清中丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量，改善小鼠体内异常的过氧化状态[5]。桑白皮联合卡托普利通过抗氧化应激改善大鼠糖尿病肾病的肾功能[6]。然而桑白皮多糖对缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤的作用及机制尚不清楚。研究报道circDLGAP4可通过靶向miR-143调节B细胞白血病/淋巴瘤2(B cell lymphoma/leukemia-2，BCL2)改善心肌缺血再灌注损伤中的心肌细胞凋亡[7]。急性缺血性中风患者的血浆和小鼠中风模型中circDLGAP4水平显著降低；circDLGAP4的过表达可改善缺血性卒中[8]。且生物学软件预测发现circDLGAP4与miR-320有结合位点。研究报道miR-320-3p具有保护大鼠心肌细胞免受缺血/再灌注损伤[9]。miR-320通过靶向A激酶相互作用蛋白1(A kinase-interacting protein 1，AKIP1)调节缺血再灌注损伤诱导的心肌细胞凋亡[10]。以上研究表明circDLGAP4和miR-320均可改善缺血再灌注损伤心肌细胞凋亡。然而circDLGAP4与miR-320的关系，及桑白皮多糖是否通过调控circDLGAP4和miR-320的表达影响心肌细胞损伤尚不清楚。本实验旨在研究桑白皮多糖对缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤的作用及机制是否与circDLGAP4和miR-320有关。

1 材料与方法

1.1 材料H9C2细胞购自上海雅吉生物公司；DMEM培养基购自美国Genmed公司；桑白皮多糖购自上海益本生物医药科技有限公司；细胞计数试剂盒8(CCK-8)试剂盒、凋亡检测试剂盒购自日本同仁研究所；蛋白提取试剂盒购自武汉纯度生物科技有限公司；MDA含量检测试剂盒、乳酸脱氢酶(LDH)、SOD活性检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；SYBR Premix ExTaqTM试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自上海臻诺生物科技有限公司。

1.2细胞处理与分组H9C2细胞用DMEM培养基常规培养，取对数生长期细胞，将其置于无氧处理过的无血清DMEM培养液中，在37 ℃、95% N2、5% CO2条件下缺氧培养6 h，然后换成正常培养液在37 ℃、5% CO2条件下复氧6 h，作为缺氧/复氧(H/R)组。正常对照组：培养H9C2细胞在37 ℃、5% CO2条件下培养相同时间，不作任何处理。

分别用0.01、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 μg/mL桑白皮多糖处理H9C2细胞及缺氧/复氧诱导H9C2细胞，检测细胞活性选晒事业浓度，而后选择0.1、0.2、0.4 μg/mL的桑白皮多糖预处理H9C2细胞然后进行缺氧/复氧处理，作为H/R+桑白皮多糖低、中、高剂量组。

将pcDNA及3个pcDNA-circDLGAP4质粒分转染至H9C2细胞，RT-qPCR检测circDLGAP4表达水平，选择表达水平较高的用于后续转染实验。H/R+pcDNA组、H/R+pcDNA-circDLGAP4组：将pcDNA、pcDNA-circDLGAP4转染至H9C2细胞后进行缺氧/复氧处理；H/R+桑白皮多糖高剂量+si-circDLGAP4组：将si-circDLGAP4转染至H9C2细胞后用0.4 μg/mL桑白皮多糖处理，再进行缺氧/复氧处理。

1.3CCK-8检测细胞活性各组细胞培养48 h，每孔加入10 μL CCK-8试剂，孵育2 h，酶标仪检测450 nm处吸光度值(A值)。

1.4流式细胞术检测细胞凋亡收集各组培养48 h的细胞，用预冷的PBS漂洗2次，与500 μL的结合缓冲液混匀；先加入10 μL的Annexin V-FITC，再加入5 μL的PI，混匀后避光孵育10 min；上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.5蛋白质印迹法检测蛋白表达提取细胞总蛋白，取适量蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转至聚偏二氟乙烯膜上，用封闭液封闭膜1 h，将膜置于加入Bax、Bcl-2一抗(1∶1000)的杂交袋中4 ℃孵育过夜；洗膜后将其置于加入二抗(1∶2000)的杂交袋中37 ℃孵育2 h，显影、成像，Quantity-One软件分析蛋白条带灰度值，以GAPDH为内参计算蛋白相对表达水平。

1.6试剂盒检测细胞MDA含量、SOD活性和培养液中LDH活性收集各组细胞，按MDA、SOD试剂盒说明检测MDA含量、SOD活性；收集细胞培养上清液，按LDH试剂盒说明书操作检测LDH活性。

1.7RT-qPCR检测circDLGAP4和miR-320的表达水平提取细胞总RNA，反转录成cDNA，按照试剂盒说明进行PCR，以GAPDH和U6为内参，用2-△△Ct法计算相对表达量。circDLGAP4上游引物序列：5'-ACGGCTACTGGTTCCTAAAGC-3'，下游引物序列：5'--GGGGTCTTCTTATACGCCACT-3'；GAPDH上游引物序列：5'-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3'，下游引物序列：5'-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3'；miR-320上游引物序列：5'-ACACTCCAGCTGGGAAAAGCTGGGTTGAGA-3'，下游引物序列：5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'；U6上游引物序列：5'-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3'，下游引物序列：5'-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。

1.8双荧光素酶报告实验构建circDLGAP4的野生型和突变型荧光素酶载体wt-circDLGAP4和mut-circDLGAP4，将wt-circDLGAP4和mut-circDLGAP4分别与miR-NC或miR-320共转染至H9C2细胞中，按照试剂盒说明检测荧光素酶活性。

2 结 果

2.1 桑白皮多糖对缺氧/复氧诱导的H9C2凋亡的影响与正常对照组相比，H/R组H9C2细胞活性降低，凋亡率升高，Bax表达水平升高，Bcl-2表达水平降低(P<0.05)；与H/R组相比，H/R+桑白皮多糖低、中、高剂量组H9C2细胞活性升高，凋亡率降低，Bax表达水平降低，Bcl-2表达水平升高，呈剂量依赖性(P<0.05)，见图1、图2，表1。

a：正常对照组；b：H/R组；c：H/R+桑白皮多糖低剂量组；d：H/R+桑白皮多糖中剂量组；e：H/R+桑白皮多糖高剂量组

表1 桑白皮多糖对H/R诱导的H9C2细胞活性和凋亡的影响

2.2桑白皮多糖对缺氧/复氧诱导的H9C2氧化应激的影响与正常对照组相比，H/R组H9C2细胞中MDA含量及LDH活性升高，SOD活性降低(P<0.05)；与H/R组相比，H/R+桑白皮多糖低、中、高剂量组H9C2细胞中MDA含量及LDH活性降低，SOD活性升高，呈剂量依赖性(P<0.05)，见表2。

表2 桑白皮多糖对H/R诱导的H9C2氧化应激的影响

2.3桑白皮多糖对缺氧/复氧诱导的H9C2中circDLGAP4和miR-320表达的影响与正常对照组相比，H/R组H9C2细胞中circDLGAP4表达水平降低，miR-320表达水平升高(P<0.05)；与H/R组相比，H/R+桑白皮多糖低、中、高剂量组H9C2细胞中circDLGAP4表达水平升高，miR-320表达水平降低，呈剂量依赖性(P<0.05)。见表3。

表3 circDLGAP4和miR-320表达的检测

2.4过表达circDLGAP4对缺氧/复氧诱导的H9C2凋亡氧化应激的影响与pcDNA组相比，pcDNA-circDLGAP4 1、2、3组circDLGAP4表达水平升高，表明转染成功，见图3。与H/R+pcDNA组相比，H/R+pcDNA-circDLGAP4组circDLGAP4表达水平升高，miR-320表达水平降低，MDA含量、LDH活性降低，SOD活性升高；H9C2细胞活性升高，H9C2细胞凋亡率及Bax表达水平降低，而Bcl-2表达水平升高(P<0.05)，见图4、图5，表4。

表4 过表达circDLGAP4对H/R诱导的H9C2细胞活性、凋亡及氧化应激的影响

2.5抑制circDLGAP4对桑白皮多糖作用的缺氧/复氧诱导的H9C2凋亡氧化应激的影响与H/R+桑白皮多糖高剂量组相比，H/R+桑白皮多糖高剂量+si-circDLGAP4组circDLGAP4表达水平降低，miR-320表达水平升高，H9C2细胞中MDA含量、LDH活性升高，SOD活性降低，H9C2细胞活性降低，H9C2细胞凋亡率及Bax表达水平升高，而Bcl-2表达水平降低(P<0.05)。见图6、图7，表5。

表5 抑制circDLGAP4可逆转桑白皮多糖对H/R诱导的H9C2细胞活性、凋亡及氧化应激的影响

2.6circDLGAP4靶向miR-320circDLGAP4和miR-320的互补序列，见图8。wt-circDLGAP4与miR-320共转染的细胞荧光素酶活性较与miR-NC共转染的降低(P<0.05)，mut-circDLGAP4与miR-320共转染的细胞荧光素酶活性无显著变化，见表6。

1：pcDNA；2：pcDNA-circDLGAP4 1；3：pcDNA-circDLGAP4 2；4：pcDNA-circDLGAP4 3

a：H/R+pcDNA组；b：H/R+pcDNA-circDLGAP4组

1：H/R+pcDNA组；2：H/R+pcDNA-circDLGAP4组

a：H/R组；b：H/R+桑白皮多糖高剂量组；c：H/R+桑白皮多糖高剂量+si-circDLGAP4组

1：H/R组；2：H/R+桑白皮多糖高剂量组；3：H/R+桑白皮多糖高剂量+si-circDLGAP4组

图8 circDLGAP4和miR-320的互补序列

表6 wt-circDLGAP4、mut-circDLGAP4与miR-320、miR-NC共转染后的细胞荧光素酶活性

3 讨 论

心肌细胞凋亡及氧化应激与缺血再灌注损伤密切相关，抑制心肌细胞凋亡及氧化应激是防治缺血再灌注损伤的重要途径[11]。中药多糖具有显著抗氧化作用，可减少氧化应激损伤[12]。研究报道桑白皮多糖对小鼠实验性肝损伤有明显保护作用[13]。从桑白皮中提取的毛果多糖可通过抑制炎症反应和减轻胰腺组织的氧化应激来改善胰腺功能[14]。本实验用缺氧/复氧诱导心肌细胞模拟缺血再灌注，用不同剂量桑白皮多糖处理，结果显示，H9C2细胞活性升高，凋亡率及Bax表达水平降低，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平升高；表明桑白皮多糖可抑制缺氧/复氧诱导心肌细胞凋亡；此外，MDA含量、LDH活性降低，而SOD活性升高；表明桑白皮多糖抑制缺氧/复氧诱导心肌细胞的氧化应激。

研究报道冠心病患者外周血白细胞以及单核巨噬细胞泡沫化进程中circDLGAP4的表达水平明显降低[15]。circDLGAP4可以通过减少细胞凋亡及线粒体损伤，从而减弱MPP +对SH-SY5Y细胞的神经毒性作用[16]。circDLGAP4通过内质网应激介导内皮细胞的缺血/再灌注损伤[17]。以上研究表明circDLGAP4可参与调控细胞损伤过程。本实验结果显示，缺氧/复氧诱导的H9C2细胞中circDLGAP4表达水平降低。过表达circDLGAP4后，MDA含量、LDH活性降低，而SOD活性升高；此外，H9C2细胞活性升高，H9C2细胞的凋亡率降低；表明过表达circDLGAP4可抑制缺氧/复氧诱导心肌细胞凋亡和氧化应激。

研究报道miR-320过表达可减弱胰岛素对心肌缺血损伤的心脏保护作用[18]。下调miR-320对心肌缺血再灌注损伤具有保护作用[19]。本实验结果显示，缺氧/复氧诱导的H9C2细胞中miR-320表达水平升高，与前人研究结果相符。且本实验发现circDLGAP4可靶向调控miR-320，提示circDLGAP4可能通过下调miR-320的表达进而影响心肌细胞损伤。此外，不同剂量桑白皮多糖处理可提高circDLGAP4表达水平，降低miR-320表达水平；说明桑白皮多糖可调控circDLGAP4和miR-320的表达；而同时抑制circDLGAP4表达和桑白皮多糖处理，MDA含量、LDH活性升高，SOD活性降低，H9C2细胞活性降低，H9C2细胞凋亡率升高；表明抑制circDLGAP4可逆转桑白皮多糖对缺氧/复氧诱导的H9C2损伤的影响。提示桑白皮多糖可能通过调控circDLGAP4/miR-320的表达影响H9C2细胞损伤。

综上所述，桑白皮多糖通过调控circDLGAP4/miR-320对缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤起保护作用。然而本实验还存在一些不足之处，目前实验仅在体外细胞中进行，其是否在体内具有同样效用还有待于进一步研究。