吴子俊，聂湘江，方文悠，高 松，李嫚嫚，陈 圆，胡容峰,3,4,5

(1.安徽中医药大学,安徽 合肥 230012；2.药物制剂技术与应用安徽省重点实验室,安徽 合肥 230012；3.新安医学教育部重点实验室，安徽 合肥 230038；4.中药复方安徽省重点实验室, 安徽 合肥 230012；5. 庐州产业创新团队——植物活性肽功能食品创制产业创新团队，安徽 合肥 230038)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)作为一种慢性非特异性肠道炎症，具有病程漫长，易复发和易癌变的特点，临床表现为腹痛、腹泻和黏液脓血便等症状。葛根芩连汤出自《伤寒论》，具有解肌表风热，内清肠胃湿热之功效。方中葛根为君药，具有解肌表风热、升脾胃清阳、清肠胃湿热的功效，臣药黄芩、黄连清热燥湿而止痢。以葛根芩连汤为基础方治疗UC的应用较为广泛。方中黄连的有效成分盐酸小檗碱具有抗菌抗腹泻、修复肠黏膜损伤、恢复肠道通透性、抗氧化应激的功效，在治疗UC过程中发挥重要作用。而目前中药治疗UC仍以传统汤剂为主，服用量大，生物利用度低并且缺少靶向性。已有学者采用有明确治疗机制的中药有效成分替代中药提取物入药，在保证疗效的同时降低药物的服用剂量。同时，配合结肠定位手段可提高结肠部位药量，从而进一步提高疗效。

本研究以药效学研究为基础对葛根芩连方进行优化，采用盐酸小檗碱替代黄连提取物，减少整体给药量，并制备成结肠定位释药胶囊，进一步提高结肠病灶部位药物含量，以期提高葛根芩连方治疗UC的疗效。

1 材料

1.1 动物 SPF级雄性SD大鼠40只，体质量(160±10) g，由安徽医科大学实验动物中心SPF级实验室提供，实验动物生产许可证号为SCXK(皖)2017-0001，使用许可证号为SYXK(皖)2017-0006。

1.2 仪器 电子天平(BS224S型)：北京赛多利斯仪器系统有限公司；磁力搅拌器(RCT B S025型)：德国 IKA集团；高速粉碎机：北京新诺立华仪器有限公司；超声清洗器(HS 10260D型)：天津恒奥科技发展有限公司。高效液相色谱仪(Agilent 1290 型)：美国安捷伦科技公司；自动溶出仪(AT 7 smart 型)：瑞士SOTAX公司。

1.3 试药 葛根(批号20180517)、黄芩(批号20190115)、黄连(批号20181103)及炙甘草(批号20190321)：购自亳州药材市场；盐酸小檗碱(批号180718)： 湖北诺克特药业股份有限公司；5% 2,4,6-三硝基苯磺酸溶液(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid ,TNBS)(批号20191213)：合肥博美生物公司；柳氮磺吡啶(批号20190715)：上海三维制药有限公司；水合氯醛(批号20191202)：上海远慕生物公司；5号结肠溶胶囊壳(批号20190218)：安徽黄山胶囊有限公司；无水乙醇(批号20190714)：上海润捷化学试剂公司；超纯水为自制。

2 方法

2.1 葛根芩连结肠定位胶囊的制备

2.1.1 葛根芩连汤剂制备 按2020年版《中华人民共和国药典》中葛根、黄芩、黄连和炙甘草的比例(8∶3∶3∶2)称取饮片适量，混匀后加8倍水浸透药材，先加热煮沸葛根约40 min后加入其他3味药材，共同煎煮2次,每次2 h，将煎液减压浓缩，得到葛根芩连全方汤剂稠膏(80 ℃热测相对密度为1.30～1.35)。经高效液相色谱法检测其中葛根素含量为64.8 mg/g，黄芩苷含量为85.1 mg/g，盐酸小檗碱含量为34.1 mg/g。另取相同比例葛根、黄芩和炙甘草同法煎煮提取稠膏，并按全方中盐酸小檗碱含量比例加入对应量盐酸小檗碱替代黄连组成简方汤剂。最终所制汤剂中含盐酸小檗碱1.0 mg/mL。

2.1.2 葛根芩连结肠定位胶囊的制备 按照汤剂中相同处方比例称取葛根、黄芩与炙甘草，并以黄连提取物中盐酸小檗碱含量称取对应处方量盐酸小檗碱原料药。取约1/4葛根粉碎成细粉,备用。剩余的葛根与处方量炙甘草加水煎煮2次，每次2 h，合并煎液，滤过，滤液浓缩至适量；黄芩用50%乙醇为溶剂，浸渍24 h后进行渗漉，收集渗漉液，回收乙醇，与上述浓缩液合并，浓缩成稠膏(80 ℃热测相对密度为1.30～1.35)，加入葛根细粉和盐酸小檗碱，混匀，干燥，粉碎，过筛，装入5号结肠溶胶囊壳中即得，每粒胶囊装入上述内容物150 mg, 含有效成分盐酸小檗碱5 mg。

2.2 葛根芩连结肠定位胶囊的质量控制研究

2.2.1 含量测定 随机取3批次所制葛根芩连结肠定位胶囊(

n

=6),取出胶囊内容物，按照文献[16]的方法测定计算单粒胶囊中葛根素、盐酸小檗碱和黄芩苷含量，与药典中葛根芩连片中各组分含量标准比较。实验结果表明，该方法在实验浓度范围下葛根素、盐酸小檗碱和黄芩苷3种成分峰面积(

y

)相对于浓度(

x

)的线性回归方程分别为：

y

=41

.

206

x

+66

.

415，

R

=0

.

999 8；

y

=32

.

954

x

+4

.

6121，

R

=0

.

999 4；

y

=40

.

415

x

-377

.

14，

R

=0

.

999 0；线性关系均良好；3种成分精密度试验的峰面积RSD分别为0.06%、0.03%、0.07%；稳定性试验的峰面积RSD分别为0.54%、0.62%、0.74%。专属性、线性关系、精密度及稳定性各项指标良好。

2.2.2 体外释放度测定 依照2020年版《中华人民共和国药典》四部通则中溶出度与释放度测定法第一法，随机取制备的结肠定位胶囊在不同时段以900 mL不同pH值的缓冲液为溶出介质，在(37±0.5)℃、转速100 r/min的条件下进行体外溶出实验。将胶囊放入篮内，前2 h以pH值为1.2的盐酸溶液作为溶出介质，随后将释放介质换为pH值为6.8的磷酸盐缓冲液并溶出3 h，最后以pH值为7.8的磷酸盐缓冲液为释放介质继续溶出12 h。从实验开始时的第2、3、5、6、8、10、12、17 h分别取样5 mL，并补以等量对应空白介质。样品过0.45 μm微孔滤膜后通过高效液相色谱法测定葛根素、黄芩苷、盐酸小檗碱的含量，计算各取样点的药物累积释放率并绘制体外释放曲线。

2.3 UC大鼠模型的复制 参照文献[17-18]的方法，采用TNBS化学刺激法复制UC大鼠模型。将适应性喂养7 d的成年雄性SD大鼠禁食24 h，期间自由饮水。大鼠麻醉后提取大鼠尾部，将儿童导尿管润滑后缓慢插入大鼠肛门深处约7 cm处，通过导尿管缓慢注入2% TNBS乙醇混合液(TNBS剂量：60 mg/kg)。注入完成后移除导尿管，并将大鼠倒置30 s并轻揉其腹部，确保药液与肠道充分接触，大鼠苏醒后自由饮食饮水。模型复制期间每日测定其粪便隐血及体质量，以大鼠体质量减轻幅度和粪便隐血程度为标准，确认模型是否复制成功。空白组大鼠以生理盐水进行相同灌肠操作。

2.4 动物分组及给药 将模型复制成功的大鼠分为5组，分别为模型组、阳性对照(柳氮磺吡啶)组、葛根芩连简方组、葛根芩连全方组和葛根芩连简方结肠定位胶囊组，每组8只。根据成人临床日用剂量换算方式(大鼠剂量相当于60 kg成人剂量6.3倍)确定各组大鼠给药方法。模型组灌胃生理盐水，每日1次。阳性对照组：以300 mg/kg的剂量灌胃12 mg/mL的柳氮磺吡啶溶液，每日1次。葛根芩连全方组：用制备的葛根芩连全方汤剂按生药量32.5 g/kg灌胃给药，每日1次。葛根芩连简方组：用制备的葛根芩连简方汤剂按生药量32.5 g/kg灌胃给药，每日1次。葛根芩连简方结肠定位胶囊组：用大鼠专用胶囊灌胃器投喂输送，按胶囊内容物0.75 g/kg给药，每日1次。另设8只大鼠作为正常对照组，灌胃生理盐水，每日1次。

2.5 药效学指标检测

2.5.1 疾病活动指数(disease activity index, DAI)评估 记录模型复制及治疗前后大鼠所排出粪便性状、粪便隐血情况和体质量变化。将此三项得分的平均值作为DAI评分,以此评价药物治疗效果。大鼠DAI评分标准：粪便性状正常，无便血，体质量下降率<1%，计0分；粪便性状松散，且隐血阳性，体质量下降率1%～5%、6%～10%、11%～15%分别计1、2、3分；粪便性状呈腹泻状，且便血肉眼可见，体质量下降率>15%，计4分。

2.5.2 结肠黏膜损伤指数(colonic mucosa damage index, CMDI)评估 将给药治疗1周的大鼠处死后，取出完整结肠，测量结肠长度并以CMDI评分标准对各组大鼠CMDI进行评分。其中结肠外观正常计0分，结肠轻度充血但无溃疡糜烂计1分，轻度充血溃疡糜烂计2分，一处溃疡糜烂且溃疡面纵径≤1 cm计3分，多处溃疡糜烂且溃疡面纵径>1 cm计4分。

3 结果

3.1 药物含量测定 经测定，3批次葛根芩连结肠定位胶囊平均每粒含葛根素9.71 mg、盐酸小檗碱5.16 mg和黄芩苷2.55 mg。

3.2 体外释放率测定 结果显示，在pH值为1.2和pH值为6.8条件下0～5 h内葛根芩连结肠定位胶囊结构保持完整并能够有效避免3种成分释放，而在结肠液中5～17 h胶囊释药孔快速溶蚀打开，3种组分能够迅速且同步释放，在12 h内基本释放完全，表明所制备的胶囊在结肠环境下能有效释放药物。见图1。

图1 葛根芩连结肠定位胶囊的体外释放曲线(n=6)

3.3 各组大鼠DAI比较 正常对照组大鼠在实验期间各阶段DAI无显著变化(

P

>0

.

05)。给药1周后，各给药组DAI明显降低(P<0.05)；葛根芩连全方组与葛根芩连简方组DAI比较，差异无统计学意义(

P

>0

.

05)；葛根芩连汤简方结肠定位胶囊组DAI明显低于葛根芩连汤简方组(

P

<0

.

05)。见表1。

表1 各组大鼠DAI比较

3.4 各组大鼠CMDI比较 与正常对照组比较，模型组大鼠CMDI明显升高(

P

<0

.

05)；与模型组比较，除葛根芩连简方组外，其他给药组大鼠CMDI显著降低(

P

<0

.

05)；葛根芩连全方组与葛根芩连简方组大鼠CMDI比较，差异无统计学意义(

P

>0

.

05)。与葛根芩连简方组比较，葛根芩连简方结肠定位胶囊组大鼠CMDI显著降低(

P

<0

.

05)。见表2。

表2 各组大鼠CMDI比较

4 讨论

目前，在中药复方治疗UC的研究中，有学者将中药有效成分的概念引入，将中药复方进行优化，以期在降低患者整体服药量的同时保证疗效。于海食等将用于治疗UC的临床经验方肠安康精简为黄芪、盐酸小檗碱和木香提取物组成的新方，并证明疗效与原方无显著差异。刘继勇等将盐酸小檗碱替代黄连提取物制成一复方结肠靶向胶囊，实验证明这单一有效成分可以替代原药发挥良好的抗炎作用。可见，采用有明确治疗机制的中药有效成分入药，在保证疗效的同时，可以明显减少服用剂量。

本研究在传统中药复方葛根芩连全方的基础上，基于黄连主要有效成分盐酸小檗碱良好的抗炎作用，以单一成分盐酸小檗碱替代全方中的黄连提取物优化设计葛根芩连方并制备出葛根芩连结肠定位释药胶囊。通过建立UC大鼠模型，以大鼠DAI、CMDI为指标，比较优化前后的的药效学差异。初步药效学实验结果表明，优化前后治疗效果相当，说明优化后的葛根芩连方适用于UC的治疗。本研究结果表明，葛根芩连结肠定位胶囊治疗溃疡性结肠炎的疗效优于原有汤剂。